仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
生命科学仪器
>
生命科学仪器综合讨论
>
帖子详情
亲和层析纯化蛋白注意事项有哪些?
Ins_bf0c01c3
2023/09/06
私聊
生命科学仪器综合讨论
亲和层析依赖于蛋白对基质结合配体的特异性和可逆性结合。该配体可以直接与目的蛋白结合或共价连接到蛋白的标签上。亲和层析通常是最有效的纯化方法,通常用在纯化方案的早期阶段。这种特定的亲和相互作用能够捕获目标蛋白,同时去除溶液中的污染物或其他分子,并一步富集或纯化目标分子,使其与其他不能结合配体的分子分离。
除了理论上蛋白能够通过免疫亲和层析纯化之外,亲和法仅限于具有特异结合特性的蛋白,而免疫亲和层析是所有亲和技术中特异性最强的。
下面是关于亲和层析纯化蛋白的注意事项!
一、
Ni
柱进行蛋白纯化时注意点:
(1)
避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如:
NH4
,甘氨酸,精氨酸,等等;
(2)
各种缓冲液中不能有强螯合剂,如
EDTA
,
EGTA
,等等;
(3)
各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,,比如
DTT
,防止二价
Ni
被还原;
(4)
不能含离子型的去垢剂,比如
SDS
,防止
Ni
流失;
(5)
在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如
0.1-1mM
的
PMSF
,防止目的蛋白被降解;
(6)
缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达
50%
(
v/v
)
(7)
应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质;
(8)
缓冲液里
NaCl
的浓度应在
300mM
到
2M
之间;
(9)
可加入变性剂促溶,盐酸胍(最高可
6M
),尿素(最高可
8M
)
(10)
可加入非离子型去垢剂,如
Triton
,
Tween
,
NP40
等,最高
2%
,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染;
二、
gst
柱进行蛋白纯化时注意点
(1)
在细胞裂解时,加入终浓度
1
–
10 mM DTT
可以显著提高
GST
融合蛋白的结合效率, 在
Binding Buffer
和
Elution Buffer
中加入
1
–
10 mM DTT
,可以提高蛋白纯度,但是会导致其产率降低
(2)
超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性,导致蛋白不能与介质结合。
(3)
在
pH
值低于
6.5
或高于
8.0
结合效率会降低,使用前需用
pH6.5
~
8.0
的
Buffer
如
PBS
进行平衡;
(4)
增大
Elution Buffer
的
pH
值。
Elution Buffer
的
pH
值调至
pH 8
–
9
可以提高洗脱效率而不需要增加
glutathione
的浓度;
(5)
增加
Elution Buffer
的离子强度。加入
0.1
–
0.2 M NaCl
能提高洗脱效率;
(6)Elution Buffer
中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍
GST
融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入
0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside
可以显著增加洗脱效率
三、
proteinA
柱进行蛋白纯化时注意点
(1)
介质的选择
A,G or
其他,其结合能力的选择
(2)
上样流速尽量小,让
Protein G
和抗体有充分的结合时间
(3)
在低
pH
值洗脱后,快速中和。
(4)
长时间保存加入
0.02-0.05
%叠氮钠;
(5)
加入
10%
甘油,可有效防止疏水作用引起的聚集。
(6)
抗体纯度不够,杂蛋白含量高,易引起蛋白的沉淀。
四、亲和层析配体和洗脱条件
更多详情
亲和层析纯化蛋白
参看:
https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac
相关话题
1
离子交换层析原理和步骤
2
提高抗体亲和力成熟方法及意义
3
重组蛋白是什么?融合蛋白和重组蛋白的区别
4
wb抗体选择单克隆还是多克隆
5
蛋白表达FAQ常见问题解析
近期热榜
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
报名开启:ICS2024第十三届光谱网络会议!
巡检超百家 丹纳赫集团参与第四届客户关怀季
推荐收藏!盘点中药材及饮片检测解决方案
热门活动
甄选国优仪器,助推设备更新
采购咨询618活动:1000元奖励等你拿
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
流式的正压和负压
已应助
2022/03/21
液氮补给罐静态蒸发率范围解析
原创
2024/05/21
深入探索纳米流式检测技术的核心原理与应用领域
分享
2024/01/29
叶面积测量仪怎么测量植物的叶面积有多少
求助
2023/08/24
岛津液相LC-2030进样器故障报错?
原创
2024/06/27
液相色谱仪
求助
2024/06/27
色谱图异常
求助
2024/06/25
HILIC柱 和 Amide柱 检测的样品中可以含有磷酸盐吗
求助
2024/06/25
企业内部校准实验室可不可以对外?
已应助
2024/06/21
苏丹红检测
求助
2024/06/21
能力验证频次
求助
2024/06/27
叶黄素可以添加到调味料里吗?
求助
2024/06/21
品牌合作伙伴
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...