仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
生命科学仪器
>
生命科学仪器综合讨论
>
帖子详情
试述制备单克隆抗体药物的工艺流程
Ins_bf0c01c3
2023/09/22
私聊
生命科学仪器综合讨论
单克隆抗体是由单一
B
细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤
(hybridoma)
抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏
B
细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为
B
细胞杂交瘤。
下面为大家讲解
制备单克隆抗体
药物的工艺流程步骤
:
1
、抗原提纯与动物免疫
对抗原的要求是纯度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原,可取
1
×
107
个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化,如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原,可将抗原所在的电泳条带切下,研磨后直接用以动物免疫。
选择与所用骨髓瘤细胞同源的
BALB/c
健康小鼠,鼠龄在
8
~
12
周,雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡,可同时免疫
3
~
4
只小鼠。
免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同,因动物、抗原形式、免疫途径不同而异,以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般
2
~
3
周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高,融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大,而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后
3
~
4
天,分离脾细胞融合。
2
、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的
B
细胞同源。如待融合的是脾细胞,各种骨髓瘤细胞株均可应用,但应用最多的是
Sp2/0
细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳,此外,该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为
9
×
105/ml
,倍增时间通常为
10
~
15h
。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大于
95
%)。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含
8-
氮鸟嘌呤的培养基作适应培养,在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为
2
×
105/ml
,次日一般即为对数生长期细胞。
在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时,还需加入其他饲养细胞(
feeder cell
)。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞,制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔,轻揉腹部数次,吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞,其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。
在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器官,否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至
1
×
105/ml
,提前一天或当天置板孔中培养。
3
、细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节,基本步骤是将两种细胞混合后加入
PEG
使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释
PEG
,消除
PEG
的作用。将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例:骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从
1:2
到
1:10
不等,常用
1:4
的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间:在两种细胞的混合细胞悬液中,第
1min
滴加
4.5ml
培养液;间隔
2min
滴加
5ml
培养液,尔后加培养液
50ml
。③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低,应随时核查培养基情况。
4
、有限稀释法
筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为
HAT
敏感细胞株,所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长,经有限稀释后(一般稀释至
0.8
个细胞
/
孔),按
Poisson
法计算,应有
36
%的孔为
1
个细胞
/
孔。细胞培养至覆盖
0
%~
20
%孔底时,吸取培养上清用
ELISA
检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔,将孔中细胞再行克隆化,尔后进行抗原特异的
ELISA
测定,选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。
5
、单克隆抗体的制备和冻存
筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用
BALB/c
小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集
5
~
10ml
的腹水,有时甚至超过
40ml
。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当,一般为
5
×
105/
鼠,可根据腹水生长情况适当增减。
选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好,冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低,而冻存在-
70
℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种,冻存过程中需格外小心。二甲亚砜(
DMSO
)是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在
50
%~
95
%之间。如果低于
50
%,则说明冻存复苏过程有问题
.
6
、单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化,腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高,纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的,也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法,多用葡萄球菌
A
蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用
Sepharose
)交联,制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱,回收率可达
90
%以上。蛋白可与
IgG1
、
IgG2a
、
IgG2b
和
IgG3
结合,同时还结合少量的
IgM
。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测,小鼠
IgG
单克隆抗体溶液在
A280nm
时,
1.44
(吸光单位)相当于
1mg/ml
。经低
pH
洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
详情可以关注:
单克隆抗体纯化
https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-purification
相关话题
1
单克隆抗体的应用你知道多少?
2
双特异性抗体较单克隆抗体的优势及制备方法
3
质粒DNA制备基本原理及方法
4
实时定量PCR技术原理及标记方法详解
5
单次与多次跨膜蛋白的特点和功能:多次跨膜蛋白的意义
近期热榜
【七月征文】不一YOUNG实验“猿”
报名开启:ICS2024第十三届光谱网络会议!
巡检超百家 丹纳赫集团参与第四届客户关怀季
推荐收藏!盘点中药材及饮片检测解决方案
热门活动
甄选国优仪器,助推设备更新
采购咨询618活动:1000元奖励等你拿
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
求所有ct机的所有资料
已应助
2022/06/12
智能超声波驱鸟器,达到既不伤鸟又解决鸟害
分享
2023/11/08
蛋白纯化的原理、操作及注意事项有哪些?
资料
2023/08/18
叶面积测量仪怎么测量植物的叶长有多少
求助
2023/08/24
highscore plus3.0
求助
2024/06/28
XRD图为什么会没有明显的峰啊?
原创
2024/06/27
求助各位,DIFFRAC以.xy格式导出数据峰强不对如何解决?
求助
2024/06/26
布鲁克广西区售后联系方式
求助
2024/06/26
能力验证频次
求助
2024/06/27
与仪器信息网相伴这数十载
原创
2024/06/25
这个场景题,按新版准则,怎么判呢
求助
2024/06/25
求助大佬!苯系物和氯代烃可以只用一个检测器吗?
求助
2024/06/26
品牌合作伙伴
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...