摘要:试样经乙酸溶解,经过滤后制备成测试溶液。经紫外法预测试,蛋白浓度较低,选择考马斯亮蓝法(Braford法)测定蛋白浓度。以BSA溶液浓度绘制标准曲线,其线性相关系数达到0.99以上。标定样品蛋白浓度时发现测量值超出标曲的有效计算范围。降低实验测试BSA浓度和反应试剂体积,重新绘制微量蛋白浓度标准曲线,测定后可得蛋白浓度为 11.05μg/ml,玉米秸秆中蛋白含量为0.221%。
关键词:蛋白质浓度;考马斯亮蓝法;玉米秸秆
1 蛋白质浓度测定方法对比
(1) 双缩脲法:双缩脲是在大约180°C条件下加热两个尿素分子,以达到释放出一个氨分子而获得的产物。在强碱性溶液中,缩二脲和硫酸铜形成紫色络合物,称为缩二脲反应。当底物中含有肽键时(多肽),试液中的铜与多肽配位,配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度,在紫外可见光谱中的波长为540nm。
(2) Folin酚试剂法:Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原,产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正相关。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多。
(3) 紫外法:蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在280nm波长处,且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系,故可作为蛋白质定量测定的依据。
(4) 考马斯亮蓝法:也称Bradford检测法,考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
2 试剂和材料
2.1 试剂
1)BSA粉末
2)乙酸
3)考马斯亮蓝试剂:(Thermo CoomassiePlus Assay Reagent)
2.2 仪器设备
1) Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro
2) 分析天平
3) 涡旋振荡器
4) 离心机
5) 石英比色皿
3 实验方法
3.1 配置样品溶液
称取粉碎均匀的样品 25mg 至 15ml 离心管中,加入 1%乙酸水溶液 5ml,样品终浓度为 5mg/ml,颠倒混匀至样品完全溶解。
3.2 配置常规蛋白浓度标准品和样品
称取BSA 粉末 2mg 左右至 2ml 离心管中,加入 1%乙酸水溶液 1ml,标准品母液终浓度为 2mg/ml。用 1%乙酸水将标准品分别稀释至表1中标准蛋白浓度。
3.3 测试
用二次水做blank。取200μl考马斯亮蓝试剂与200μl标准品/样品混合,室温放置10分钟,测定在595nm波长吸收值。每个测试样品至少重复三次。
3.4 配置微量蛋白浓度标准品
称取BSA 粉末 2mg 左右至 2ml 离心管中,加入 1%乙酸水溶液 1ml,标准品母液终浓度为 2mg/ml。用 1%乙酸水将标准品分别稀释至表 2 中标准蛋白浓度。
3.5 微量蛋白浓度测试
用二次水做blank。取750μl考马斯亮蓝试剂与25μl标准品/样品混合,室温放置10分钟,测定在595nm波长吸收值。每个测试样品至少重复三次。
4 结果
4.1 绘制标准曲线
根据 125~1000 μg/ml OD595 绘制标准曲线,获得线性相关曲线如图 1。线性相关方程为 y=0.0008x + 0.0522,R2=0.9937。
图1 常规浓度标准曲线
4.2 测定并计算蛋白浓度
经过分析检测,标准品和样品与亮蓝G-250试剂反应后OD595nm吸收峰为如下:
表1 标准曲线测定
标准物(BSA)
浓度(μg/ml)
|
0
|
25
|
125
|
250
|
500
|
750
|
1000
|
1500
|
2000
|
样品
(5mg/ml)
|
OD(595nm)
|
0.348
|
0.339
|
0.466
|
0.546
|
0.737
|
1.014
|
1.160
|
1.265
|
1.399
|
0.341
|
|
0.327
|
0.345
|
0.466
|
0.589
|
0.822
|
0.992
|
1.107
|
1.257
|
1.406
|
0.350
|
|
0.309
|
0.347
|
0.471
|
0.589
|
0.821
|
1.024
|
1.187
|
1.255
|
1.433
|
0.354
|
平均值
|
0.328
|
0.343667
|
0.467667
|
0.574667
|
0.793333
|
1.01
|
1.151333
|
1.259
|
1.412667
|
0.348333
|
扣除blank
|
|
0.015667
|
0.139667
|
0.246667
|
0.465333
|
0.682
|
0.823333
|
0.931
|
1.084667
|
|
带入标准曲线由此计算可得样品中蛋白含量过低,超出标准曲线范围。因此采用微量浓度测定方法。
4.3 绘制微量蛋白浓度标准曲线
根据 3~30 μg/mlOD595 绘制标准曲线,获得线性相关曲线如图 1。线性相关方程为 y=0.0166x + 0.0845,R2=0.9906。
图2 微量浓度标准曲线
4.4测定并计算蛋白浓度
由此计算可得样品中蛋白浓度为 11.05 μg/ml,蛋白含量为0.221%。
表2 微量蛋白浓度标准曲线测定
标准物(BSA)
浓度(μg/ml)
|
0
|
3
|
6
|
12
|
24
|
30
|
样品
(5mg/ml)
|
OD(595nm)
|
0.256
|
0.365
|
0.43
|
0.561
|
0.744
|
0.828
|
0.521
|
|
0.245
|
0.371
|
0.44
|
0.557
|
0.744
|
0.811
|
0.526
|
|
0.253
|
0.361
|
0.44
|
0.564
|
0.747
|
0.816
|
0.511
|
平均值
|
0.251333
|
0.365667
|
0.436667
|
0.560667
|
0.745
|
0.818333
|
0.519333
|
扣除blank
|
|
0.114334
|
0.185334
|
0.309334
|
0.493667
|
0.567
|
0.268
|