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液相色谱使用过程中的问题分享

通标小菜鸟

2023/10/31
菜鸟分析队

液相色谱（LC）

液相色谱使用过程中的问题分享

一. 新柱子买回来没用多久就发现系统压力升高？

排查：首先确定压力升高的来源，将色谱柱拆下，接上两通，然后开启流动相，观察压力是否正常，如果接两通显示系统压力高，那说明系统存在堵点。然后继续排查压力升高的位置。如果接上两通后发现压力正常，那说明柱子存在堵点，如果色谱柱装有保护柱，先将保护柱拆下，确认堵点是否存在保护柱。通过管路分段排查找到堵点，然后用流动相低流速冲洗。

经验：为避免发生堵塞情况，延长色谱柱使用寿命，建议对使用的流动相加强过滤，特别是每次配制含盐的流动相时，需要超声充分溶解，然后过个0.22um或者0.45um的微孔滤膜，然后再用于仪器。对于分析的样品，特别是固体样品溶解后建议使用0.22um针式过滤器进行过滤上机。对于水相通道，勤更换试剂水，避免长时间放置长菌，如想延长水相放置时间，可以在水相中加入少许有机试剂，如乙腈。
二. 液相色谱分析目标物出峰正常，但时不时有“鬼峰”？

排查：1、首先确认鬼峰是否来源于样品，对于出现“鬼峰”情况的样品进行连续多次进样，然后对色谱图进行叠图分析，如果多次进样鬼峰均有，且峰大小差不多，那说明鬼峰来源于样品基质。

2、连续进样有时有，有时没有，那说明不是来源于样品基质，继续排查，拿一个空的进样小瓶，进行连续进样，如果有鬼峰，那说明可能是来源于流动相的污染或者是色谱柱上的残留。

3、除了上述样品基质和流动相，色谱柱污染以外，当无头绪时，还要留意液相色谱进样针系统以及装样品的器皿，瓶子及过滤用的滤膜等器材。

三．液相分析过程中发现保留时间不稳定怎么办？

1、保留时间不稳定，最常见的情况就是流动相脱气不完全，有气泡存在。所以每次更换流动相后需要充分脱气，即使仪器自带脱气机，也还是建议初步超声脱气。

2、色谱柱平衡不充分，在运行序列之前，需要充分平衡色谱柱，在排样前可以提前二十分钟将流速开启，让其进行平衡。如果流动相中使用了离子对试剂，建议延长平衡时间。

3、流动相混合不均匀，如果使用的流动相不是单一的有机相或者水相，里面加入了盐或者其他物质，在放上仪器前需要充分混匀，可以利用超声或者振摇进行充分混匀。

4、样品基质本身的影响，当我们分析的样品pH值不是单一的，有高有低，跨度大，那也可能造成保留时间不稳定的情况，此时可以在流动相中加入缓冲盐，如加入0.1%的磷酸，对保留时间的稳定具有一定的效果。

四、流动相的使用注意事项有哪些？

日常使用的流动相主要分为有机相和水相，在有机相的选择上，建议购买HPLC级别的试剂，不建议为了省几个钱购买低级别的试剂。对于水相，可以使用实验室纯水机自制的纯水。不管是有机相还是水相，在上机前都建议使用0.45um或者0.22um微孔滤膜进行过滤以去除试剂中可能存在的颗粒物，如果不这样做，在使用过程中，系统压力可能会随着时间的积累而慢慢升高。在流动相有效期方面，建议水相现配现用，存放于棕色瓶中进行避光存储，以免长菌，每天更换新的水相，在不使用水相通道的时候可以将其换成有机相并充分灌注管路替换水相。如有机相使用到乙腈，也需要将乙腈存储于棕色瓶中避光，因为乙腈在适宜的温度和光照作用下会聚合成絮状聚合物，一旦进入液相系统后会附着在系统内，所以有用到乙腈的也需要注意。

五、液相流动相中如使用缓冲盐需要注意哪些问题？

使用缓冲盐那必然会用到各种缓冲盐试剂，缓冲盐试剂有固体有液体，一般来说使用的缓冲盐试剂等级为分析纯的比较多，那就意味着试剂中可能存在一定量的固体颗粒及杂质，因此在用到缓冲盐时也需要对混有缓冲盐的流动相充分过滤并超声溶解加脱气。有些分析员可能会为了图方便，一次性配制很多缓冲盐流动相放在那边，然后仪器上走的差不多了再将之前配制好的拿出来加入流动相瓶中，这种做法不推荐，最好还是现配现用，每次用完了再进行配制。在使用缓冲盐时，建议固定放在某个通道，比如固定放在C通道，这样每次走完样品，对C通道进行一个充分得冲洗，避免盐类物质在管路内析出造成压力升高堵塞。

六、流动相超声脱气过程中有哪些注意事项？

使用的流动相上机前推荐进行超声，超声建议放在玻璃瓶内进行超声，不建议放在塑料容器内超声，一是因为塑料瓶内超声没有玻璃瓶效率好，还有一点是因为使用的塑料器皿假如质量不好，而超声的流动相中又有有机试剂，可能会将塑料器皿中的一些杂质溶出，可能会在分析过程中出现异常出峰。流动相超声时间不宜过长，5～10min比较合适，长时间超声会造成温度升高，可能会导致流动相组成发生变化。

七、如何正确选择水相和有机相过滤的微孔滤膜？

在流动相过滤和样品过滤过程中，免不了使用滤膜，现在滤膜的品种比较多，容易混淆。1、PTFE聚四氟乙烯膜，它具有抗酸抗碱以及抗各种有机试剂的特性，具有亲水性和疏水性两种，亲水性膜即可以用于水相过滤也可以用于有机相的过滤。2、尼龙膜，具有良好的化学稳定性和柔韧性，适合过滤水溶液和大多数有机溶剂。3、PES聚醚砜膜，它具有天然的亲水性，水通量高，具体高流速、低蛋白吸附性等特性。4、PVDF聚偏二氟乙烯，机械强度高，化学稳定性好，分为亲水和疏水两种，在使用时注意甄别。5、醋酸纤维素膜，适用于乙醇以及水相过滤。

八、进样前样品处理及进样小瓶使用有哪些要注意？

样品在进样前需要进行过滤，避免样品中有不溶颗粒而造成系统压力升高。样品一般装在2ml进样小瓶内，如果过滤后的样品量比较少，低于0.5ml刻度线，建议使用内插管（垫高管），可以增加液体高度，让进样针能够吸到样品。如果样品进样量比较大且需要连续进多次，推荐使用预开口进样小瓶盖，避免因为负压造成吸取样品体积不一致，进而导致重复性变差。

九、溶剂过滤头如何进行清洗？

液相仪器上的溶剂过滤头一直泡在溶剂里面，时间长了会有不溶颗粒物堵塞在微孔里面，也可能长藻类，这种情况会导致溶剂的过滤效果变差，为了恢复溶剂过滤头的过滤效率，我们可以每隔一段时间对其进行清洗，做一个定期维护保养。我们可以将过滤头从管线上拆下，然后放置于预先装有30%左右硝酸溶液的烧杯中浸泡一小时。如果是玻璃过滤头，那不能进行超声，否则会损坏，如果是不锈钢的那种过滤头，不能用硝酸浸泡，而是用有异丙醇浸泡，然后放置于超声波仪器中超声一段时间。不管是哪种材质过滤器，用酸泡和异丙醇泡过后都要用去离子水充分清洗置换掉浸泡液。由于过滤器每次清洗可能会造成一定的损伤，久而久之其过滤效率也会降低，因此建议几次清洗后更换新的过滤器，毕竟过滤器本身也属于一种耗材，虽然其价格不低，但对于损坏仪器和堵柱子相比，成本还是要低一些。

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可以通过样品净化的方式，如果目标物浓度还可以，也可以通过样品稀释的方式来降低基质带来的影响。还有一些可以通过配制基质标来校正样品目标物
Ins_b4c321bc(Ins_b4c321bc) 发表:如果鬼峰来源于基质，那要怎么解决它呢，进溶剂没有峰，一进样品就有峰，而且保留时间不定

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第4楼2023/11/30

我做纯度测定，需要测杂质含量，是固体样品溶解在乙腈里，不能净化

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第5楼2024/05/26

过水膜的时候把溶质过没了，怎
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