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蛋白质浓度测定的各种方法及原理

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2023/12/15

生命科学仪器综合讨论

蛋白质浓度测定的各种方法及原理是生物化学和分子生物学实验中的重要环节。蛋白质浓度的准确测定对于研究生物分子相互作用、蛋白质功能和动力学、以及生物样品的分析和鉴定等方面都具有重要的意义。本文将介绍几种常用的蛋白质浓度测定方法及其原理，包括紫外吸收法、微量凯氏定氮法、双缩尿法、Lowry 法和考马斯亮蓝法等。通过对这些方法的比较和分析，可以更好地了解它们的优缺点，以便根据实际实验需求选择合适的方法来测定蛋白质浓度。

①紫外吸收法

检测原理：

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共扼双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，进行蛋白质含量的测定。

方法特点：

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

缺点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多。

干扰物：含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质。

检出限：50~100ug蛋白含量。

适用范围：适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

②微量凯氏定氮法

凯氏定氮法被国内外视为蛋白质含量的标准检验方法，可作为衡量其他蛋白质含量检测方法准确性的标准。

实验原理：

样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

方法特点：

优点：通用性强，测定费用低，易实现，仪器简单且测定结果的重复性和重现性好。

缺点：实验耗时长、灵敏度低。

检出限：0.2~1mg蛋白含量。

适用范围：凯氏定氮法测的是总蛋白的量，一些非蛋白氮无法检测出。

③双缩尿法

实验原理：

双缩尿（NH3CONHCONH3）是两个分子经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱溶液中，双缩尿与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩尿反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽链，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩尿反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。

方法特点：

优点：适合检测总蛋白质的含量，操作简单、测量速度快。

缺点：标准物质必须使用代表性很强的样品，需使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量，故测定工作费力费时。不宜测定样品种类多、彼此差异大的样品。

检出限：测定蛋白质含量测定范围为1-20mg蛋白质。

干扰物：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

适用范围：常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

④Lowry 法

Lowry 法是双缩脲法的发展，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是最灵敏的蛋白质测定方法之一，在生物化学领域得到广泛的应用，目前分为基本法和改良简易法，改良简易法可获得与基本法相近的结果。

基本法实验原理：

显色原理与双缩尿法相同，但加入了Folin-酚酞试剂，以增加显色量，从而提高检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：①在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。②Folin一酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

特点：

优点：灵敏度高。

缺点：耗费时间长，操作时间需精准控制，标准曲线绘制麻烦，专一性较差，干扰物质比较多。

检出限：可检测的最低蛋白质量达5ug。通常测定范围是20~250ug。

干扰物：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等。

适用范围：除蛋白含量测定，也可用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

⑤考马斯亮蓝法

实验原理：

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465mm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595mm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

方法特点：

优点：灵敏度比Lowry高约4倍，高效率、检测过程简便、只需要一种试剂，抗干扰能力强。

缺点：测定误差大，不适用于不同蛋白的检测。

检出限：其最低蛋白质检测量可达1ug。

干扰物：干扰物质少，但去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、0.1N的NaOH会干扰实验测定。

蛋白质含量测定方法选择

蛋白质含量测定时，考虑以下因素后选定适用的检测方法。

①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；

②蛋白质的性质；

③溶液中存在的干扰物质；

④测定所要花费的时间。

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