仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
生命科学仪器
>
生命科学仪器综合讨论
>
帖子详情
稳定转染细胞株构建:方法与实践中的常见问题解析
Ins_bf0c01c3
2024/01/03
私聊
生命科学仪器综合讨论
随着生物技术的快速发展,稳定转染细胞株的构建在基础研究和应用研究中变得越来越重要。这一技术涉及到将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中,从而实现基因的长期表达。然而,这一过程也伴随着一系列的挑战和常见问题。本文将深入探讨稳转细胞株构建的方法,以及在实践过程中可能遇到的问题,旨在为研究者提供实用的指导和建议。
稳定转染细胞株构建方法:
一、慢病毒感染细胞
慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞,包装技术成熟,
II
代和
III
代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒,是稳转细胞系构建的首选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制,不适合转录本区域比较长的基因,对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒,病毒表达载体中,是由
WPRE
元件代替
PolyA
稳定以达到稳定
mRNA
的作用,对部分基因的翻译有一定影响。
二、转座子介导的稳转细胞系构建
转座子是存在于各种生命细胞内的可移动遗传信息元件,能实现
DNA
片段在染色体内部
/
之间的转移。工程化的转座子由
ITR
和转座酶编码基因组成,通过转座酶与
ITR
结合实现基因转移。将转座子的两个元件分别构建在两个独立载体上,并将目的基因序列替换转座酶序列,与另一个载体共转染目的细胞,实现目的基因在宿主基因组上的整合。与其他技术不同,目的基因在整合酶存在下会持续处于切割—整合状态,实现连续跳跃。
三、
CRISPR/Cas9
基因敲入
利用
CRISPR/Cas9
系统,通过
NHEJ
和
HDR
修复机制,可将目的基因(如抗性基因和荧光标志)定点敲入细胞基因组。在哺乳动物细胞中,
NHEJ
的效率高于
HDR
。设计特定
sgRNA
和
donor
载体,可在
AAVS1
位点(人基因组安全港)实现基因定点敲入。此方法稳定、安全,但敲入概率在不同细胞和位点中有所差异,需筛选单克隆以获得稳定细胞系。随着编辑效率提高,此方法将更省时省力。
四、
CRISPR SAM
系统,通过融合
VP64
、
MS2-P65-HSF1
系统对基因进行过表达和干扰
CRISPR SAM
通过
dCas9-VP64
、
MS2-P65-HSF1
激活蛋白实现了多数细胞内源基因的特异性激活,不受基因大小限制。主要优势是应用广泛,但需要三种不同抗性病毒逐次或同时感染细胞。
CRISPR SAM
将
sgRNA
序列构建在
lenti
载体中,配合其他两种慢病毒可激活任何基因。主要缺点是筛选细胞时需要三种不同抗性的病毒,部分细胞筛选后表型变化明显。
稳转细胞系构建中常见问题解析:
1.
是否需要进行密码子优化?
由于氨基酸密码子的简并性和
tRNA
的种类多样性、数量的差异,密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性,可以大幅提高目标蛋白的表达量。
2. Kozak
序列是必须要添加的吗?
Kozak
序列(通常是
GCCACCatgG
),真核生物
mRNA
真正的起始密码子位于
Kozak
序列的保守序列中,其共有序列是
CCRCCAUGG
,几乎所有
mRNA
的翻译起始都依赖于
5
’帽子结构募集小亚基,少数通过内部核糖体进入位点
(IRES)
募集小亚基。
Kozak
序列通过与翻译起始因子
eIF
形成翻译起始复合物,起始蛋白的翻译。
3.
启动子应如何选择?
CMV
(巨细胞病毒)启动子除了在干细胞外,其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中
SFFV
启动子表达活性相对较高。而
EF1a
(延伸因子
-1
α)启动子更适用于表达长片段的基因。
CMV
;
EF1A
;
CAG
;
CBh
;
SFFV
,等均属于强启动子,都可作为稳转细胞系构建可选启动子。
4.
稳转细胞系培养体系
稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长,如
hepG2
细胞
puro
抗性筛选浓度为
2
μ
g/ml
,则建议用
1ug/mL+
完全培养基维持生长;部分基因过表达后会影响细胞代谢,尤其肿瘤细胞,糖酵解代谢速率受影响,细胞生长缓慢,可相应添加葡萄糖或者
HEPES
调节细胞细胞代谢水平,维持细胞增殖。
5.
标签放在
N
端还是
C
端好?
如果
N
端有信号肽,建议放在
C
端;蛋白如果较小,建议放在
C
端,减少蛋白降解;如果下游有
P2A
,
T2A
等自剪切肽,建议放在
C
端。如果为了添加
Kozak
序列,建议加在
N
端。如果纯化中需要酶切标签,建议放在
N
端。
6.
是否可以构建稳转敲除的细胞系?
一般不建议,因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中,累积脱靶效应明显,影响细胞状态。
义翘神州提供
稳定细胞系构建服务
,包含过表达细胞系构建服务和
CHO
稳定细胞株开发服务,其服务内容详情可以参看:
https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service
相关话题
1
抗独特型抗体制备与应用探索
2
多重荧光免疫组化(TSA):原理、优势与实操关键
3
深入了解组织芯片:制作与应用指南
4
酶联免疫吸附试验elisa 原理及优缺点
5
亲和层析法的原理及操作步骤
近期热榜
2024“世界环境日”有奖征文活动启动!
巡检超百家 丹纳赫集团参与第四届客户关怀季
【第4届客户关怀月】SCIEX公司远程指导
第三届“信立方杯”微课大赛开始报名啦!
热门活动
甄选国优仪器,助推设备更新
采购咨询618活动:1000元奖励等你拿
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
免疫组化抗体(IHC)的实践应用与常见问题详解
资料
2024/01/16
全能核酸酶SuperNucleaseFAQ详解:解开核酸酶的神秘面纱
资料
2023/10/25
流式细胞分析方案详解:从步骤到流式免疫检测的全面指南
资料
2023/12/08
叶面积测量仪测量植物的平均叶面积有多少
求助
2023/08/24
高性价比液晶驱动芯片,低工作电流VKL144A/VKL144B-资料
分享
2024/06/21
MALDI TOF MS分析储存在甲醇乙腈中的小分子化合物,事先用含有NaCl,MgSO4,PSA伯仲胺试剂提取,离心后检测
新手求助
2024/06/21
LED数显IC数显驱动原厂VK16K33数码管驱动厂家资料
分享
2024/06/20
老师们,用液相测恩诺沙星不出峰我该怎么解决啊
求助
2024/06/20
质控样的测试结果如何评价?
求助
2024/06/18
记录扫描保存后可以废弃纸质版吗?
已应助
2024/06/18
ppm单位的计算
原创
2024/06/16
做气相检测时用的色谱试剂,顶空试剂,农残试剂和GC级别的怎么区分使用?可以互换使用吗?对检测结果有什么影响?
求助
2024/06/18
品牌合作伙伴
6月26日 马尔文帕纳科现场直播间
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...