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Fitc标记抗体：原理、方法及注意事项的详解

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2024/01/11

生命科学仪器综合讨论

Fitc标记抗体是一种广泛应用于生物医学研究的工具，它结合了荧光染料和抗体的特性，为研究者提供了可视化、定量和定位细胞和组织中目标分子的能力。了解Fitc标记抗体的原理、方法及注意事项，是成功应用这一技术的关键。

FITC标记抗体的原理

FITC异硫氰酸荧光素是目前较为常用的标记抗体的方法，FITC一般呈黄色、褐色或褐黄色粉末或结晶，性质稳定在低温中能保存数年。在碱性条件下，FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基共价结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个抗体分子上最多能标记15~20个FITC分子，被标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过荧光显微镜进行观察或利用流式细胞仪分析，从而对抗原进行定性、定位或定量。

FITC标记抗体方法

FITC抗体标记主要有Marshall直接标记法、Chadwick间接标记法、改良标记法和透析法四种。

1、Marshall直接标记法

①抗体的准备：取提纯的Ig溶液测定蛋白质含量，置于三角烧瓶中加入生理盐水和0.5mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，冰槽中搅拌5~10min；

②荧光素的准备：按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算，准确称取后加入抗体溶液中；

③标记：边搅拌边加入荧光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h；

④透析：结合完毕后，先将结合物以3000r/min离心20min，除去少量沉淀物后装入透析袋中再置于pH8.0缓冲盐的烧杯中透析过夜；

⑤过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离的FITC，收集标记的荧光抗体进行鉴定。

2、Chadwick间接标记法

①抗体的准备：0~4℃下，用0.01mol/L pH8.0 PBS将待标记的抗体蛋白溶液稀释到浓度为30~40mg/ml，置于三角烧瓶内放入冰槽中；

②荧光素的准备：按每毫克蛋白质加入0.01mg的荧光素称取，溶解于等量的3%重碳酸钠水溶液中；将抗体蛋白溶液与FITC溶液等量混合，在0~4℃中搅拌18~24h，充分搅匀；

③透析或过柱层析。

3、改良法

①抗体的准备：取提纯的Ig溶液测定蛋白质含量，置于三角烧瓶中加入生理盐水和0.5mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液，冰槽中搅拌5~10min；

②荧光素的准备：按每毫克蛋白质加0.01~0.02mg的FITC计算，准确称取后加入抗体溶液中；

③标记：边搅拌边加入荧光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰库继续搅拌12~18h；

④用半饱和硫酸铵将标记的抗体蛋白沉淀分离，3000r/min离心30min，倾去上清液中的游离荧光素，再用缓冲盐水透析除去硫酸铵。将制备好的荧光抗体加0.01%NaN3,分装保存。

4、透析法

①用0.025mol/L PH9.2碳酸盐缓冲液，将待标记的抗体蛋白稀释成1%浓度，装入透析袋中；

②用同一缓冲液将FITC制成0.1mg/ml的溶液，置于圆形容器内，并将透析袋浸没其中，4℃搅拌24h；

③取出透析袋中标记液。立即过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，除去游离荧光素，收集荧光抗体进行鉴定。

FITC抗体标记注意事项

①影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白的量等，需注意控制；

②荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适当避免气泡的产生；

③层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气泡、裂隙；

④上样和洗脱应做到“前切”和“后切”。前切指柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品，后切指样品走至与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。

更多抗体标记详情可以关注义翘神州：https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation

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