1 我对生化样品不熟悉，但是对于水相样品，作标准曲线不一定非要用多糖，可以选用PEO（好像叫“氧化聚乙烯”，我不确定）做标样，就很方便，完全可以很方便地找到窄分布、甚至是单分布的标样。而且分子量范围也可以很大。
2 小角激光光散射确实不能做ZIMM图，您说对了。那时因为LALS不需要做ZIMM图。首先做ZIMM图不一定就是对的吧？其次，难道多角外推法LS就做ZIMM图了吗？据我所知，瑞利散射的原理，就是样品浓度、散射角度都无限趋近于0时，样品分子量与散射光的强度成正比。而ZIMM图法实际上是20世纪40年代以后出现的理论，由于当时的技术条件所限，无法得到哪怕是近似的0度角散射光强，因此才出现了多角外推法的理论。我也是从课本上学来这些的（高分子物理教材），也不是很确定这些内容，但是我觉得至少从瑞利散射的公式中可以看出这个说法的正确性的一面。再说多角外推法,其实一般的仪器供应商所提供的仪器，也是不做ZIMM图的，因为那样的话需要对一个样品配置不同浓度的溶液，然后再依次作测试，有些麻烦，所以实际操作中的都是一次进样，此时，准确的名称叫：“德拜”图(Debye)，即：只有角度外推，而没有浓度外推。配置成很稀的样品溶液，近似认为浓度是零。大部分用户实际使用的，应该是这种方法。做ZIMM图不是目的，是手段！目的是为了外推出0度的光散射强度。如果我用其他方法，近似得到了0度的光散射强度，代入经典公式计算即可得到相对准确的分子量，也是很好的、很实用的方法，那么我为什么还要去费劲地做ZIMM图呢？
加过滤器是为了将样品中的杂质去除，因为不论是对于大规模工业化生产的样品，还是实验室自己合成的样品，往往含有非高分子/生物大分子杂质（杂质是什么就很复杂了，有空儿再聊），有些颗粒会堵塞管路和检测器，所以需要过滤。过滤器有时候确实会出现将样品分子剪切的现象，但是那种情况往往是没有选择合适的过滤器的滤膜，滤膜一般是0.45u的，当你的样品分子量比较大的时候，你可以选择0.8u的滤膜，这样一般情况下就不会发生剪切效应了。而且，补充一句，由于往往采用手动进样，因此当真正发生剪切的时候，你在进样的时候是能感觉到压力很大，进不去，这时候才往往真正会发生剪切。否则，如果您的样品在小小的过滤膜上、在比较小的泵压力下就剪切了，那么样品的凝聚态做熔融指数、拉力机实验的时候，力量远比这点儿泵压大得多啊，您的样品还不彻底降解啊？那么您的样品还谈什么加工性能呢？又有什么实际应用的意义呢？实际上那是不可能的。塑料农膜在大太阳下晒好几年都不带降解的（否则就没有白色垃圾了），甭提这点儿温度、压力和良溶剂的影响了。
其次，如果发生了所谓的剪切效应，那么实际上往往与样品的溶解情况有关。如果你合成的样品非常稳定、在溶剂中不降解，那么一般情况下发生剪切的机率很小，更多的情况是样品在溶剂中没有完全溶解好，样品分子之间由于存在电性等原因使得部分分子团聚在一起而没有真正分散/溶解在溶剂中，而多角外推法的LS检测器灵敏度稍差（原理所限），无法分辨出来在样品峰前面出现的团聚、积聚或蒂和的样品团，于是就认为是过滤造成的，或者是剪切了，其实往往是误解。不知道我是否说清楚了。实际上，与GPC联机的光散射检测器，与脱机的光散射仪还是有很大不同的。最大的遗憾，就是许多实际用户只是学习、研究高分子的，而不是研究色谱仪器的，对色谱类仪器的一些通用的技术和知识全然不知造成的。过滤器的事就是比较典型的例子。还有，例如：死体积、样品前处理、色谱柱上的分离等等，都是与高分子的应用和色谱类仪器的基础知识密切相关的。
小角法LS可以做到非常大的分子量，一般地，1、2千万的分子量，误差与质谱、核磁等仪器测试的数据相比，偏差不大于2%，这是一个非常了不起的成绩。
3 那我可能记错了，对不起！但是去年我曾经去过那里，只见到了一些三个角度的仪器。也许有变化吧。但是，说句不好听的话，你也别介意。18个角就一定正确吗？17个角行不行？19个角行不行？20个呢？180个角呢？多少个角度算是准确的呢？角度是越多越好吗？如果是，那么多到什么程度算是最好、最准呢？其实，多角外推法是非常尴尬的技术，尤其是那些联机在GPC上的。仅仅检测器死体积一事，就使得多角外推法失去了意义！关于这个话题，有空儿再聊吧。
脱机的多角外推法光散射仪还是非常棒的、非常有用的仪器，但是对于高分子/生物大分子样品的分子量分布和绝对/相对分子量的测定而言，有些“牛刀杀鸡”的感觉。呵呵，我也是自己的看法，不一定正确。就先聊到这儿吧。“真理总是越辩越清”，很高兴能有机会相互切磋、交流啊。但是，别伤了和气，否则我就只好不聊了。

1,楼主是做多糖药物的，所以必须按照药典来做，药典规定为多糖标样，那必须用多糖标样。
2，按照普通GPC的测试原则，选用与样品最为近似的标样做校准曲线。所以这就是多糖难用GPC测准的原因。PEG是可以得到分散度为1左右的窄标，但PEG的结构比特殊，在溶液中的尺寸比较大，所以用PEG可能更不合适。
基于以上两点我才说“没意义”。尤其是药典的规定。

对于“Zimm不一定对”的问题我不敢苟同。因为如果Zimm不对，那么Debye更不可能对，Debye是Zimm的变形公式，少了+2A2C.因该说Zimm法使用的局限性较大，而且得到的信息较少。
LSL的愿望是好的，但有些问题我一直没有搞懂：
小角肯定灵敏，但同时噪音也大，所以加了池前的在线过滤，但在线过滤的死体积肯定不比多角度的死体积小。LAL难道不受溶剂扩散的影响么？
高分子样品一般都是多分散的，平均分子量100万的，最高的部分可能有几百万甚至上千万，那低的分子量可能又会很低，如果用大孔的膜，大分子肯定都过去了，但噪音必然升高，影响小分子的检测，，用小孔的膜，那大分子又该如何呢？
作为检测器单纯强调灵敏度其实没有意义，实际的是信噪比。而且池前的在线过滤肯定是一般液相的检测非常避讳的，严重的“修饰”了样品的信号。
剪切作用的影响往往和样品本身也有很大关系。

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对于“Zimm不一定对”的问题我不敢苟同。因为如果Zimm不对，那么Debye更不可能对，Debye是Zimm的变形公式，少了+2A2C.因该说Zimm法使用的局限性较大，而且得到的信息较少。
LSL的愿望是好的，但有些问题我一直没有搞懂：
小角肯定灵敏，但同时噪音也大，所以加了池前的在线过滤，但在线过滤的死体积肯定不比多角度的死体积小。LAL难道不受溶剂扩散的影响么？
高分子样品一般都是多分散的，平均分子量100万的，最高的部分可能有几百万甚至上千万，那低的分子量可能又会很低，如果用大孔的膜，大分子肯定都过去了，但噪音必然升高，影响小分子的检测，，用小孔的膜，那大分子又该如何呢？
作为检测器单纯强调灵敏度其实没有意义，实际的是信噪比。而且池前的在线过滤肯定是一般液相的检测非常避讳的，严重的“修饰”了样品的信号。
剪切作用的影响往往和样品本身也有很大关系。[/quote]


我确实对生化样品不懂。所以如果你说药典规定用多糖标样，那就没辙了。咱不能跟药典对着干，呵呵。
小角LS噪音大是肯定的，无疑义的。但同时也是有办法解决的！那就是采用了立体取光的原理，而不是像多角法MALS那样是结构简单的平面取光，并且同时还减少了样品池体积，其光路类似和路雪的冰激淋蛋桶，是个圆锥状的，与透射光的夹角是小于10度，7度居多。这样，就可以放过去透射光，从而极大地排除了透射光对小角散射的影响，最大程度地降低了噪音，而同时取光光强却较大，因为立体取光，是取了一圈的光，再到光电二极管等光电转换设备中，再计算等等。这样，小角光散的效果还是非常好的，当然，分子量太小就不行了，而分子量越大越好、越准。
过滤主要是为了滤除未溶解的颗粒杂质，主要是为了保护检测器和管路系统，其作用与进样前的过滤是一样的。这当然有可能把一些没溶解的样品滤掉了，但是那不是仪器的问题，而是样品溶解的问题。如果样品都完全溶解了，过滤是不会影响分析数据准确性的，而且过滤膜尺寸很小、很薄，扩散效应几乎可以忽略不计，在色谱图上也是没有任何影响的。我们的FIPA柱才会看到扩散效应，那是因为柱子很粗，而管路相对很细，使得峰形有些拖尾，但是由于FIPA柱只是把大分子与小分子分开，并不做分子量分布，所以有点儿拖尾也没关系，这个方法主要用于反应釜内的聚合过程监控。而过滤膜是没有这种现象的。
信噪比，其实就是灵敏度。MALS由于要安放很多个取光角，因此使得样品池小不下来，因此样品池很大，而且RI检测器不是专用的，都是从普通液相色谱仪厂家拿来的，因此都是不能承受反压的，所以必须把MALS放在RI的前面，造成了较大的样品池对已经在色谱柱上分离了的样品又进行了一定程度的混合，从而造成了死体积较大，对于窄分布、单分布的样品就会产生较大影响，使得峰形变宽、分子量分布不准确！这可以用传统的单一RI检测器的GPC来验证。另外，MALS还需要较大的光源光强，否则大于90度的角的信号会较弱，而光强越大，噪音也就越大，信噪比就差了，所以灵敏度不足。脱机的多角外推法的光散射仪，光强更大，远大于GPC上用的LS检测器的光强。所以MALS的样品池一般都在70ul左右，而小角的样品池，只有大约18ul。现在，做液相色谱仪的厂家的UV、RI的样品池一般都小于10ul了！光强，MALS一般是LALS的两倍以上。
在线过滤绝不会严重影响信号，因为一般地，溶解后的样品的尺寸远小于过滤膜的孔径！对小分子的、小尺寸的根本不影响。而且，如果使用者觉得有影响，可以不装过滤器不就行了吗。实际上，对于溶解很好、没有杂质颗粒的样品，过滤与不过滤没有区别。而且，做液相色谱仪的几乎都知道，进样前要用0.45u的过滤器过滤啊！对于0.45u的过滤膜，除非样品达到近千万左右的分子量，才会很费劲地进样，一般地，样品在几百万以下时，过滤膜都不会影响样品数据的。而且，不是池前过滤，是柱前过滤。

楼主的感觉是对的，就应该用峰值分子量做标准曲线！我仍然建议先用单分布、窄分布的标样重新作标准曲线，然后进一针标样看一下结果。如果数据比较准确，那么说明仪器和柱子都基本正常，这样至少可以排除一些影响因素，有利于找到问题所在。
另外，你的另一个感觉也正确，关于浓度，虽然不参与计算，但是浓度太高，不仅会堵柱子，而且也可能超过检测器的量程，从而出现平头峰。而浓度过低，有可能使检测器检测不到信号。紫外检测器还好些，而示差检测器灵敏度要差些。因此，浓度对分析结果是有影响的。选择合适的浓度，才会得到“好看”的色谱峰，而选择浓度，实际上是需要摸索方法的，比较复杂。

应助达人

楼主说得很对，所以我们在做GPC的时候，都是尽量用稀溶液来做，但要仪器能检测到信号，如果太稀，信号太弱，就没有噪音覆盖了。

稀溶液，1%（10mg/ml）以下

请教十楼：高分子角度依赖性是什么？目前多角度的激光散射检测器比两角度的检测器有什么样的优势？谢谢！

高分子的角度依赖简单点说，当样品分子的粒径大于入射光波长的1/20，它的散射光是各向异性的，类似一个椭圆，检测角度越小光强越强；当粒径小的时候，也就是低于1/20的时候散射光就是各向同性，说白了就是个同心圆，光强各个方向一样。
所以对于分子量一般情况下低于10万的，有一个角度就够了，但分子量越大，光散射的各向异性就越明显，所以多角度就更准确。
这个光散射的理论太复杂，我也搞得不是很懂，只能说一些大概的，简单的，你可以看一看高分子物理。
多角度可以单机做最经典的Zimm图，测分子量，两角度肯定不行。Zimm是光散射最基本的理论基础，不能否定，否则就不是光散射了。但做出来这能得到一个平均重均分子量等3个值，现在看来信息太少，用处不大，而且操作麻烦。
所以，现在一般都是用Debye法，它是Zimm的一个变形公式，也就是说在多角光散射和2角或小角光散射和GPC联用时，一般用的都是Debye公式，样品浓度极稀，直接由此浓度外推到浓度为零，再将角度外推到角度为0，这条曲线的截距就是分子量的倒数，曲线接近零点的斜率与分子的构想相关，也就是和rg相关。这样的好处是操作简单，而且可以测分布和构象等更简单但得到的信息更多。
大家想想，两点就可以定一条直线，但最好多些点来进行修正和拟合是不是应该更准？所以多角应该比两角结果更准。
而且光散射还有一个问题，低角度灵敏，但同时意味着低角度噪音更大，信噪比更差，所以往往在分子量大的时候，低角度才能用。这也就是小角光散射必须加一个在线过滤的原因，但它是检测器前加，溶剂扩散的影响不能排除，而且滤掉了一些高分子的，那你的数据是否可信呢？

谢谢，很好的解释，收获了不少！
我还有一个问题，就是大家有用高温GPC 的么？一般都选什么样的柱子？

GPC侧分子量本身就不准，是相对值，最好采用GPC和光散射联用。