BBN007
第21楼2009/03/31
色谱柱
• 打开包装,首先用“运输试剂”冲洗色谱柱1~2小时,流速0.5ml/min。大约相当于10~20倍的柱体积。
• 所谓“运输试剂”是指色谱柱出厂后柱管内封存的试剂,每种柱子所用的试剂不相同。
• 对于常用的C18柱,这种试剂采用甲醇即可。其它类型的色谱柱看其相应说明书而定。
• 色谱柱如果长期不用,冲洗干净之后,也应该用该种“运输试剂”充满,然后用堵头封好保存。
• 使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)
• 大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围
• 避免流动相组成及极性的剧烈变化
• 流动相使用前必须经脱气和过滤处理
• 压力升高是需要更换预柱的信号
• 非常简单,但是非常重要:冲洗!
• 对于常用的C18反相柱,如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相(含有酸、碱、盐的流动相),应在实验完毕后用水将柱子冲洗干净,然后保存于甲醇或乙腈之中。
• 溶剂中的不溶物
应使用色谱纯溶剂,膜过滤(孔径不超过0.45μm)
• 样品中的不溶物
应对样品进行膜过滤(孔径不超过0.45μm)
• 泵、进样器等中的不溶物
在泵和进样器之间、进样器和柱子之间安装在线过滤器
• 由于溶剂的不互溶而产生的柱内不溶物沉淀
用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱
• 在不互溶溶剂中由于进样而产生的柱内不溶物沉淀
检查样品溶液和流动相是否互溶
• 由于温度的改变或固定相的干涸而产生的柱内不溶物沉淀
将色谱柱密封紧,并保持室温恒定
• 由于固定相对某些样品的强烈吸附而在柱头形成沉淀
使用相近填料的预柱(保护柱),并定期更换
• 步骤1:使用含盐缓冲液后(如离子对试剂)应用溶解性强的溶剂(如水)进行冲洗
• 步骤2:先断开检测器,使用对样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗。对于反相色谱柱,可使用甲醇、乙睛、四氢呋喃、氯仿、庚烷等。在此条件下,应避免溶剂的pH 低于2 或高于8。
若经过步骤1 和步骤2 后,压力仍没下降,进行步骤3
• 步骤3:断开检测器,将色谱柱反方向放置,然后检查柱压
(1) 若压力稳定下降,进行步骤4
(2) 若压力不下降,进行步骤5
• 步骤4:保持色谱柱反方向连接,用低于0.5 ml/min 流速冲洗1~2 小时,然后换回正常方向,重复步骤1、步骤2即可。
• 步骤5:若内置过滤器被堵塞,应冲洗或更换。但柱连接端的拆卸或重装会导致柱效下降(有效塔板数下降和不对称峰等)。若步骤5 不能降低柱压,进行步骤6。
• 步骤6:若进口端的填料发生堵塞,柱子将不可能被彻底恢复,只能通过去掉进口端的部分填料,重新填充,进行有限的柱效恢复。在多数情况下,柱效将严重地下降。
• 步骤7:若步骤6 无法改善柱子性能,那么柱子已无法修复,只能更换新柱子。
• 在对-NH2改性的色谱柱(氨基柱)进行再生时,由于-NH2可能以铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
• 如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。