动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺残留量的测定 气相色谱-质谱法

1　范围
本标准规定了气相色谱－质谱（GC－MS）法测定动物组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等4种β2-兴奋剂残留量的方法。

本标准适用于畜禽肌肉、肝脏、肺、肾等组织中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等4种β2-兴奋剂残留量的测定。

本方法检测限为：特布他林1.0μg/kg、克伦特罗2.0μg/kg、沙丁胺醇1.0μg/kg、莱克多巴胺2.0μg/kg。

2　规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3　方法原理
试样加入内标物后，用甲醇提取和离子交换固相萃取柱净化，氮气吹干，与N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）进行衍生化反应，于气相色谱－质谱仪上进行测定。内标法定量。

4　试剂和溶液
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验室用水为去离子水，应符合GB/T 6682二级水的规定。
4.1　甲醇
4.2　乙酸乙酯：色谱纯
4.3　氨水
4.4　盐酸
4.5　0.2mol/L盐酸溶液：取盐酸（4.4）9mL，加水至500mL，摇匀，即得。
4.6　30mmol/L盐酸溶液：取0.2mol/L盐酸溶液（4.5）15mL，加水至100mL，摇匀，即得。
4.7　无水硫酸钠：450℃干燥12h，备用。
4.8　正己烷
4.9　甲苯：色谱纯
4.10　衍生剂：N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）
4.11　4％氨水/乙酸乙酯溶液：取氨水（4.3）4mL加乙酸乙酯（4.2）至100mL，超声15min，充分混匀，即配即用。
4.12　SLS阳离子交换固相萃取柱1)：每根柱填料量为400mg，柱体积5mL。
4.13　标准品：特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，纯度≥98%。
4.14　同位素内标物：D9-克伦特罗100μg/mL，D3-沙丁胺醇100μg/mL。
4.15　β2-兴奋剂标准储备液：取特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺标准品（4.13）10mg，



1)SLS阳离子交换固相萃取柱是由杭州富裕科技服务有限公司提供的产品的商品名称，给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是主管部门对这一产品的认可。
精密称定，分别置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，其浓度均为0.1mg/mL，置-20℃以下冰箱中保存，有效期为6个月。

4.16　β2-兴奋剂混合标准工作液：分别准确吸取适量的β2-兴奋剂标准储备液（4.15）于同一容量瓶中，用甲醇稀释成含特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺均为1.0μg/mL的混合标准工作液，置4℃～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。

4.17　β2-兴奋剂内标工作液：分别准确吸取适量的β2-兴奋剂同位素内标物（4.14）于同一容量瓶中，用甲醇稀释成含D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇均为1.0μg/mL混合内标工作液，置4℃～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。

5　仪器设备
5.1　气相色谱-质谱仪：配有电子轰击（EI）源。
5.2　离心机：最大转速9000r/min或以上。
5.3　组织绞碎机。
5.4　组织匀浆机：最大转速10000r/min或以上。
5.5　分液漏斗：125 mL。
5.6　具塞玻璃试管：5mL，10mL。
5.7　涡旋混合器。
5.8　分析天平：感量0.00001g，0.01g。
5.9　超声波清洗器。
5.10　离心管：50mL，10mL。
5.11　氮吹仪。
5.12　移液器：量程20μL～200μL，100μL～1000μL。

6　分析步骤
6.1　试样制备
取有代表性的样品，经绞碎后，保存于-20℃冰箱中，备用。
6.2　试样提取
称取试样5g（精确到0.01g），置于50mL离心管中，加β2-兴奋剂内标工作液（4.17）50μL；加甲醇20mL，10000r/min以上均质60s，加盖，于60℃超声波清洗器中超声20min；取出离心管，冷却后8000r/min离心10min，倾出上清液至分液漏斗中，另取甲醇10mL重复提取一次，合并上清液；加正己烷20mL脱脂一次，分离甲醇相，在60℃下氮气吹至2mL以下；加0.2mol/L盐酸（4.5）3mL，充分混匀后，在9000r/min离心10min，分出上清液，备用。
6.3　试样净化
依次用甲醇5mL、水5mL、30mmoL/L盐酸溶液（4.6）5mL润洗阳离子交换固相萃取柱（4.12），取6.2上清液过柱，弃去流出液，并依次用水5mL和甲醇5mL淋洗柱子，抽干；用4％氨水/乙酸乙酯溶液（4.11）10mL洗脱，收集洗脱液，经无水硫酸钠（4.7）脱水，50℃氮气吹干；残余物中加乙酸乙酯5mL，置于超声波清洗器中超声5min，5000r/min离心5min，分出上清液至5mL具塞玻璃试管中，50℃氮吹至干，吹干物备用。
6.4　衍生化
吹干物加入甲苯（4.9）100μL和衍生剂（4.10）100μL，加塞后于涡旋混合器充分混匀，在80℃±5℃的烘箱中恒温衍生60min，氮气吹干，加甲苯0.5mL溶解供GC-MS分析。
另取β2-兴奋剂混合标准工作液（4.16）适量，加β2-兴奋剂内标工作液（4.17）50μL，加乙酸乙酯5mL后，氮气吹干，与样品同步进行衍生化。

我们也是同样的问题，标样走的重现性不好，通常都是越来越高

标样因为要衍生，越来越高可能是基质造成的。

动物尿液中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺
残留量的测定 气相色谱-质谱法
1　范围
本标准规定了气相色谱－质谱（GC－MS）法测定动物尿液中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺等4种β2-兴奋剂残留量的方法。
本标准适用于猪、牛、羊等动物尿液中特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺等4种β2-兴奋剂残留量的测定。
本方法检测限为：特布他林1.0μg/L、克伦特罗2.0μg/L、沙丁胺醇1.0μg/L、莱克多巴胺2.0μg/L。
2　规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3　方法原理
试样加入内标物，调节pH值至2.0后，过阳离子交换固相萃取柱，氮气吹干，与N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）进行衍生化反应，于气相色谱－质谱仪上进行测定。内标法定量。
4　试剂和溶液
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验室用水为去离子水，应符合GB/T 6682二级水的规定。
4.1　甲醇。
4.2　乙酸乙酯：色谱纯。
4.3　氨水。
4.4　盐酸。
4.5　2mol/L盐酸溶液：取盐酸（4.4）18mL，加水至100mL，摇匀，即得。
4.6　30mmol/L盐酸溶液：取2mol/L盐酸溶液（4.5）3mL，加水至200mL，摇匀，即得。
4.7　无水硫酸钠：450℃干燥12h，备用。
4.8　甲苯：色谱纯
4.9　衍生剂：N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）。
4.10　4％氨水/乙酸乙酯溶液：取氨水（4.3）4mL加乙酸乙酯（4.2）至100mL，超声15min，充分混匀，即配即用。
4.11　SLS阳离子交换固相萃取柱1）：每根柱填料量为400mg，柱体积5mL。
4.12　标准品：特布他林、 克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，纯度≥98%。
4.13　同位素内标物溶液：D9-克伦特罗100μg/mL，D3-沙丁胺醇100μg/mL。
4.14　β2-兴奋剂标准储备液：取特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺标准品（4.12）10mg，精密称定，分别置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，其浓度均为0.1mg/mL，置-20℃以下冰箱中保存，有效期为6个月。

1）SLS阳离子交换固相萃取柱是由杭州富裕科技服务有限公司提供的产品的商品名称，给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便，而不是主管部门对这一产品的认可。
4.15　β2-兴奋剂混合标准工作液：分别准确吸取适量的β2-兴奋剂标准储备液（4.15）于同一容量瓶中，用甲醇稀释成含特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺均为1.0μg/mL的混合标准工作液，置4℃～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。
4.16　β2-兴奋剂内标工作液：分别准确吸取适量的β2-兴奋剂同位素内标物（4.14）于同一容量瓶中，用甲醇稀释成含D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇均为1.0μg/mL混合内标工作液，置4℃～8℃冰箱中保存，有效期为1个月。
5　仪器设备
5.1　气相色谱-质谱仪：配有电子轰击（EI）源。
5.2　离心机：最大转速5000r/min或以上。
5.3　固相萃取装置。
5.4　涡旋混合器。
5.5　分析天平：感量0.00001g。
5.6　烘箱。
5.7　离心管：10mL。
5.8　氮吹仪。
5.9　pH计。
5.10　具塞玻璃试管：5mL，10mL。
5.11　移液器：量程20μL～200μL，100μL～1000μL。
6　测定步骤
6.1　试样制备
采集的尿液应保存于4℃～8℃冰箱中，尿液有如有混浊，应经离心处理，备用。
6.2　试样净化
准确量取试样5mL至10mL离心管中，加β2-兴奋剂内标工作液（4.16）50μL，用2mol/L盐酸溶液（4.5）调节pH值至2.0，5000r/min离心5min，试样液备用。
依次用甲醇5mL、水5mL、30mmol/L盐酸溶液（4.6）5mL润洗阳离子交换固相萃取柱（4.11）；取试样液上柱，并依次用水5mL、甲醇5mL淋洗柱子，抽干；用4％氨水/乙酸乙酯溶液（4.10）10mL洗脱，收集洗脱液，经无水硫酸钠（4.7）脱水，50℃氮气吹干；残余物中加乙酸乙酯5mL，置于超声波清洗器中超声5min，5000r/min离心5min，取上清液至5mL具塞玻璃试管中，50℃氮气吹干，吹干物备用。
6.3　衍生化
吹干物加入甲苯（4.8）100μL和衍生剂（4.9）100μL，加塞后于涡旋混合器充分混匀，在80℃±5℃的烘箱中恒温衍生60min，氮气吹干，加甲苯0.5mL溶解供GC-MS分析。
另取β2-兴奋剂混合标准工作液（4.15）适量，加β2-兴奋剂内标工作液（4.16）50μL，加乙酸乙酯5mL后，氮气吹干，与试样同步进行衍生化。

尿样测定其实很简单，就是过柱控制好就好了。

过柱要控制流速吗？是不是不能让柱子干掉，一定要使柱子保持在湿润状态

尿样调节ph后可能有沉淀，要离心除去，过柱好自然下滴就可以了，关键在洗脱，氨化乙酸乙酯要混匀，下滴慢时可以加压一下。
你拿一个标准溶液过柱，绝对回收要在80%以上。然后相对回收就很好控制了。

应助达人

我在培训时，老帅是这么说过，这很重要

离心的转速对实验会有影响吗？我们单位离心机最大转速为4000r/min

尿样好象够了，至少没有肉眼看的见的杂质，否则离心后过滤。
猪肉离心是很重要的。