6、RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul，反应条件如下：

注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。
* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检验
1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。
2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：
（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；
（2）没有足够的人类细胞以备检测；
（3）方法建立和实施不当；
（4）试剂和仪器原因。
3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：
（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。
（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。
（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。
2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。
3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物

NIC引物    引物名称    碱基组成    目的片段大小    备注
FluA    FluA-M-F30    TTCTAACCGAGGTCGAAACG    235bp    甲型流感病毒M基因通用检测引物
    FluA-M-R264    ACAAAGCGTCTACGCTGCAG       
H1HA    H1 F1147    AAGAGCACACATAATGCCAT    527bp    H1N1亚型检测通用引物
    H1 R1673    CCATTRGARCACATCCAG       
HuH1HA    H1HA F768    ACTACTGGACTCTGCTGGAAC    327bp    人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物
    H1HA R1094    CAATGAAACCGGCAATGGCTCC       
SWH1HA-1    SW-H1 F786    AATAACATTAGAAGCAACTGG    153bp    此次甲型H1N1亚型流感病毒引物
    SW-H1 R920    AGGCTGGTGTTTATRGCACC       
RnaseP    RnaseP F    AGA TTT GGA CCT GCG AGC G    约80bp    与real-time PCR中RnaseP引物一致
    RnaseP R    GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT       

三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）
6、检测引物
7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器
11、可调转速14K离心机：
12、旋涡混合器：
13、生物安全柜：二级生物安全柜
14、PCR仪：
15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪

甲型H1N1流感病毒的鸡胚分离方法
一、目的
流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保鸡胚分离甲型H1N1病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
二、操作程序
（一）生物安全要求
甲型H1N1病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3，实验操作人员需进行BSL-3级防护。甲型H1N1病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
（二）材料
1、9～10日龄SPF鸡胚
2、照卵灯
3、70%～75％酒精
4、一次性1ml注射器，22号针头
5、鸡卵开孔器
6、胶水或医用胶布
7、15mL无菌离心管、试管架
8、10mL无菌移液管
9、无菌镊子

甲型H1N1流感病毒的MDCK细胞分离方法

一、目的
流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保MDCK细胞分离甲型H1N1病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
二、程序
（一）生物安全要求
甲型H1N1病毒的MDCK细胞分离培养实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护。甲型H1N1病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
（二）材料
1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离
2、TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）
3、HEPES缓冲液，1M母液 （GIBCO Cat No 15630）
4、D-MEM培养基（高糖含有L-谷氨酰胺 GIBCO Cat No 11965），Hank's液(病毒所配液室配制)
5、青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G；10000 µg/mL硫酸链霉素 （GIBCO Cat No 15140）
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15620）
7、临床样品0.5mL
8、1mL无菌移液管
9、10mL无菌移液管
10、15mL无菌离心管

还有电子显微镜

红外测温仪
还有： 生意社5月4日讯　中国农业部新闻办公室3日发布消息称，农业部组织专家开展联合攻关，已成功研制出猪感染甲型H1N1病毒RT-PCR检测试剂盒，可在5小时内完成猪感染甲型H1N1病毒快速检测。

酶标仪可以用吧，把血液样品打进去就OK了，买个试剂盒就能测了

口罩

毛细管电泳，DNA鉴定仪，酶分析仪

应助达人

还有PCR扩增应该用得较多。