值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
1)避免重复碱基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。
3）GC=30-80%.
4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
6)PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

影响PCR的因素太多了，往往有些是怎么想都想不同的问题。

如果实验室条件不是特别特别好的话，夏天和冬天做PCR时，如果比较倒霉的话就会有很大的差别。而且都是分子级别的东西，看不见，摸不着，会很郁闷的。。。。有时候就是很很很很很很郁闷。。

我曾经就有半年的时间利用PCR做定点突变，，，怎么做就是PCR扩增不出来，，，实在是郁闷到底。。。。最后把老板也搞郁闷了。。

PCR 常见问题分析与对策


PCR 常见问题分析与对策

引物设计的一个PPT


引 物 设 计

PCR结束后就是电泳分析了。

电泳技术目前发展得还算是比较成熟的。对于大片断，一般500bp以上采用琼脂糖凝胶电泳。对于小片断，想获得高分辨率的电泳图一般用PAGE 电泳。

楼主写得很好，多谢！加油接着写啊！

不错的帖子，学习一下

好帖子！必顶！认真学习了！希望楼主再接再厉！

你好，我是做核酸蛋白检测仪的，目前国内做蛋白质纯化分离实验比较多，但是国产仪器普遍知道做到定性，真正达到定量还是有一段距离需要走的，有一篇关于核酸蛋白检测的说明可以分享下：http://www.wuhan17.com/whasp-Article-74254/

很好很好，我是新手。希望你继续发帖