兴奋剂类分析方法系列讲座(12)-综述促红细胞生成素检测方法 促红细胞生成素的血液检测方法
摘 要:重组人促红细胞生成素(rHuEPO)被禁止用于提高运动员的成绩,但是用常规的检测方法很难区分内源性EPO和外源性EPO。运动员使用EPO后,会导致其一些血液参数的变化,通过对这些血液参数的检测,可以间接判定运动员是否使用了EPO。笔者综述了促红细胞生成素的血液检测方法的研究进展,明确指明了EPO血液检测的原理和方法,并重点讨论了转铁蛋白受体和网织红细胞参数等指标的检测原理和方法。
本文由华东师范大学体育与健康学院的周 刚、许豪文两位老师共同完成检测促红细胞生成素在血液中含量及综述,同时介绍悉尼奥运会的EPO血检方法,以利我国奥运会检测人员参考。
1 EP0和rHuEPO
增加红细胞量对于提高运动成绩的好处已被广泛的报道。就目前而言,增加血红细胞量的途径主要有:持续的艰苦训练或高原训练;采用血液回输技术; 注射促红细胞生成素。
毫无疑问,即使在高水平运动员中,靠持续的艰苦训练或高原训练,要大幅度地提高自身固有的血液浓度和血红蛋白含量是很困难的。于是,有人便另辟“捷径”, 企图通过采用不正当手段来实现上述目的。20世纪70年代.一些长跑运动员曾在慕尼黑(1972)和蒙特利尔(1976)两届运动会上利用自体输血的技术参加比赛,有的运动员还取得了金牌 [1]。随着检测技术的发展,用常规的尿检方法已能很容易地检测出血液兴奋剂的滥用,于是,一些运动员便转向使用其它尿检不易查出的兴奋剂,这其中便包括EPO [2]。 而今,促红细胞生成素已成为目前国际体坛“最具欺骗性的药物”。
人体的肾脏能产生一种红细胞生成酶(erythrogenin),这种酶作用于肝脏所产生的促红细胞生成素的前身(一种α-球蛋白)促红细胞生成原(erythropoietinogen),它们在血浆中转变成人促红细胞生成素 (Erythropoietin,EPO) [3 ]。最近发现,肝细胞和巨噬细胞也能产生EPO。EPO属酸性糖蛋白,它与红细胞前体细胞表面EPO受体结合,促进其血红蛋白的合成,使之增殖分化成红细胞,从而调节体内红细胞和血红蛋白的生理平衡。它的表达有其严格的组织特异性,同时严格受体内氧分压的控制。正常情况下人血液中EPO水平保持在4×10 -3 ~24×10 -3 U/mL,再生障碍性贫血患者因组织严重缺氧,血液中EPO水平可高达10U/mL [4]。
早年从再生障碍性贫血病人的尿中、胎肾细胞的培养液中可获得较多的EPO。1985年应用基因重组技术, 获得重组人EPO (Recombinant Human Erythropoietin,rHuEPO),有了大量纯品EPO 的问世,使EPO 得以在临床上广泛应用[5—6 ]。rHuEPO与EPO的作用极为相似,可以明显提高人体的红细胞数量及血红蛋白含量,从而提高人体运输氧的能力,提高人体最大摄氧量。在使用rHuEPO 4—7天后,rHuEPO已恢复正常水平,应用常规检测的色谱学方法无法查出,而其功效还可持续四周之久,这正是有氧耐力运动员所期望的。因此,在2 0世纪80年代,人工合成的rHuEPO开始被用作体育训练及竞赛中的辅助药物,个别人为了追求良好的训练及比赛成绩并逃避药检,越来越多地服用此类药物,rHuEPO也被直接称为EPO。然而,rHuEPO的滥用可导致血小板功能亢进、高血压、中风等疾病,严重者甚至死亡。有鉴于此,1989年国际奥委会医学委员会将EPO等4种人工合成的肽类激素正式列为禁用药物。
2 rHuEPO的血液检测原理
由于检测技术的原因,EPO在体能类运动项目中的滥用一直无法进行有效的控制。有三个方面的因素限制了EPO的检测,这些因素是:其一,rHuEPO 与内源性EPO的分子结构极为相似。EPO是一种含有166个氨基酸的单链酸性糖蛋白,分子量为34000D (道尔顿),而rHuEPO的分子量为30400D,也是单链糖蛋白[7]。现在还没有技术能从统计学上鉴别、分离和确定rHuEPO的数量 [8 ];其二,rHuEPO与内源性EPO相似的临床效果。其功能都是刺激造血祖细胞分化为红细胞;其三,rHuEPO的平均半衰期大约为6h,大多数rHuEPO在1—3d内被身体清除,然而其功效仍可以持续四周[9]。因此,按常规的尿检或血检方法很难直接检测出rHuEPO的存在,更少有机会通过血清的EPO水平检测出滥用者,尤其是在竞赛期间。
研究表明,在停止注射EPO四周后,体内EPO恢复到正常水平,甚至低于正常水平 。这就是说,为了保持其有效性,兴奋剂使用者不得不在赛前四周内注射rHuEPO,而最佳的使用效果是在赛前两周内注射。这就给兴奋剂检测者提供了一个检测出当前或最近使用了rHuEP0的运动员的机会。
从这个思路入手,一些研究表明:rHu EPO的使用不可避免地会导致血液中一些生理生化指标的改变,这些指标包括可溶性转铁蛋白受体(soluble transfemin Receptor,sTfr)和与血红细胞及网织红细胞相关的各种参数,如红细胞压积(hematocrit,Hct),血红蛋白含量(Haemoqlobin,Hb)和网织红细胞计数(reticulocyte count, # retic) 等等[2、8、11、13、14]。依赖于对这些间接指标的检测, 与没有用rHuEPO的正常人的指标相比较,可用于查明运动员当前或近期滥用rHu EPO,这是目前EPO检测的一个现实思路。
国际自行车联合会曾以红细胞压积(Hct)超过50%为界线来判定使用了EPO [15],而国际业余滑冰组织则以血红蛋白(Hb)超过18.5g×dL -1 来判定明显地使用了EPO。然而,Hct和Hb是相当粗糙的血液特征检测指标。血液特征受脱水,心情和运动方式的影响,并且50% 的限制不排除个别优秀运动员有自然的高Hct。
早期的研究还有检测滥用rHuEPO 的间接指标Tfr [14,16,17]。 一项最近的研究指出,在最后一次使用rHuEPO后的25d内,Tfr还高于正常水平。一项运动员使用rHuEPO的药动学研究表明,尽管用药后4到7天内EPO已回落到正常水平,但直到用药后第14d,许多血液学指标还高于正常水平 。
另外,最近的几项关于rHuEPO的研究报道, 网织红细胞绝对计数(# retic),每个网织红细胞的血红蛋白含量(CHr),网织红细胞的血红蛋白总量(RetHb),血红细胞的血红蛋白与网织红细胞的血红蛋白的比率(RBCHb:RetHb)等指标也可做为检测rHuEPO的间接指标 [8,10,11]。国内外现在已有大量关于EPO检测方法的报道,下面重点对EPO的血液检测方法做一综述。
3 rHuEPO的血液检测方法
3.1 转铁蛋白受体(Transferrin Receptor,Tfr)
Tfr为一双糖蛋白,分子量为2×94000D,实际上存在于所有细胞的表面上。但成人中,约有80%存在于骨髓成红细胞中。当红细胞受到EPO的刺激时,Tfr会将与其结合的血液中富含的转铁蛋白中的铁转移到血红蛋白的卟啉中。随着红细胞的成熟,Tfr及Tfr的一些碎片将被释放进入血液循环。因此,以免疫方法定量测定血中的Tfr及其碎片可以提供一个可能的方法以检测外源EPO的使用。国内外许多相关的实验都证实了Tfr作为检测rHuEPO的间接指标的可靠性[11,13,14,17]。以下是一些这方面的实例。
加拿大的Gareau等人报道:以50100 IU/kg.bw的EPO进行每周三次的皮下注射后,以酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定给药组 (n=24) 血清中的Tfr的浓度为3135±312ng/mL,而对照组 (n=6) 的血清浓度为2195 ±225ng/mL (P<0.001) [16]。在Gareau等人的另一项实验中也得出同样结果,rHuEPO的滥用导致Tfr的延迟性增加和fr (铁蛋白) 的延迟性减少,及Tfr/fr升高。作者提出,可用Tfr和Tfr/fr作为检测运动员滥用rHuEPO的指标 [l4]。
方子龙等给6名健康青年男性受试者皮下注射rHuEPO,剂量为30 IU/kg体重,每周3次,持续4周,采用ELISA进行指标测定。结果表明,注射rHuEPO能提高血清EPO浓度和转铁蛋白可溶性受体Tfr的浓度;在停药后1个星期左右的时间内,Tfr浓度仍保持在较高水平。结果提示:血清EPO和Tfr浓度有可能作为rHuEPO检测的指标 [18]。
法国的Audran等人也做了相关的实验:给9名运动员每人每天皮下注射50 IU / kg的rHuEPO,持续26天。分别于用药期10,14,17,24天和用药后1,3,7,14,25天抽取
血样分析。结果表明,rHuEPO的滥用,使运动员的有氧能力明显提高,同时,用药期间及停药两周内Tfr和Tfr/fr均显著升高。作者提出,以Tfr高于10 μg/mL和Tfr/fr高于
153,来判定是否使用了rHuEPO [11]。
多年来,国外在Tfr的检测方面已做了大量的研究,可以肯定的是,Tfr已成为目前EPO检测中最为可靠,最为常用的指标。