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zxhcnf
第11楼2010/05/27
我认为您方法开发过程中存在这样几个问题和建议：
1. 一上来就用25mmol ph8的磷酸盐缓冲液：乙腈=95：5 来作流动相我认为不太合适。因为这个流动相的洗脱能力非常弱，如果有保留能力比较强的物质，它可能就根本出不来，那您说您的样品里面只有三种主要物质，这个结论是不能得到的。
2. 体系的频繁变化，从乙腈体系变成甲醇体系，缓冲盐也变了，pH也变了，您一下子改变了这么多的内容，谱图出现了变化，您能判断是因为哪个条件变化了引起的吗？原因不好查，方法上没有持续性，方法开发思路不是很清晰。
3. pH的变化对极性比较大的化合物，特别是容易电离的化合物的保留时间影响非常大，也因此常用于调节样品分离度的一个重要手段。您的流动相pH变化也是非常大，一下就从pH8变到了3.5，获得完全迥异的峰，甚至三个峰变得只剩下一个峰，这样没有持续性的变化不太好，如此说来您得到谱图就不让人感到意外了。
4. 一个建议：液相的工作需要耐心，该出来的峰得让它出来，你得尊重它的规律，不能太急。比如第一个图变成第二个图，流动相体系、pH变化这么多，多出来一个峰，从哪里来的就搞不清楚了。还有第二个图变成第三个图的时候，第三个图里面出现的最后一个峰在图3上都没出来，就因此判断这两个图上各自9min的那个峰是同一个峰，不对的，您把流动相比例改动了，图2上5min的那个峰其实就是图3上9min出来的那个峰；而图2上9min处的峰在图3上根本还没出来，但是您已经把液相停了。
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chqiu111111
第15楼2010/05/29
首先感谢朋友的建议！
我想请问一下，为什么要首先选择210nm呢？依据是什么呢？我只知道我们应该选择最佳吸收波长。
恩，我会再试试你说的。zxhcnf(zxhcnf) 发表:首先感谢楼主的辛苦，让我们一起分享您的经验，谢谢！
您这个应该属于方法开发，方法开发的过程通常是按这样一个顺序来进行的：
1. 首选C18柱；
2. 确定检测波长，如果波长不能很好的确定，则选用210nm，用乙腈和水的体系来进行初步的实验；
3. 先用纯乙腈（如果波长确定了，并且甲醇不会带来本底影响时，首选甲醇）来做流动相，看它的总的峰高和峰面积是怎么样的；因为这么强的洗脱能力，通常会把所有的组分都洗脱出来，那你就清楚总体是个什么样子了。
4. 然后再将流动相中乙腈的比例10％的量递减，看谱图里面峰会出现什么样的变化,如从纯乙腈做流动相变为乙腈：水＝90：10时，会多出来几个峰？峰大不大？峰朝哪个地方移动？这样10％的变化，一步一步的，流动相从纯乙腈变道纯水，你就可以大致的知道，你的样品有几种物质，这些峰从哪个峰里面分出来的，这些峰的来龙去脉都弄得清清楚楚。（当然，有梯度泵就简单多了，用不着10％的量来调）
5. 选一个认为分得比较好的条件，再来调节pH，分开后，再来想办法调整峰形。
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chqiu111111
第16楼2010/05/29
呵呵，十分感谢你的建议。我选择25mmol ph8的磷酸盐缓冲液：乙腈=95：5 来作为流动相是因为之前做了与这个类似物质，那个物质是用这个流动相来分离得很好，所以我就选择了这个，还有就是我试了用水来做，但是发现有倒峰出现。
呵呵，这些流动相的体系我肯定不是一天做完的哈，我是分了几天做的，是洗完柱子后才做的，所以基本没有什么影响了，呵呵！
不过我还在继续摸索最好的条件！从C18的性质出发，各个方面去排除。再次对你的建议表示感谢！！！zxhcnf(zxhcnf) 发表:我认为您方法开发过程中存在这样几个问题和建议：
1. 一上来就用25mmol ph8的磷酸盐缓冲液：乙腈=95：5 来作流动相我认为不太合适。因为这个流动相的洗脱能力非常弱，如果有保留能力比较强的物质，它可能就根本出不来，那您说您的样品里面只有三种主要物质，这个结论是不能得到的。
2. 体系的频繁变化，从乙腈体系变成甲醇体系，缓冲盐也变了，pH也变了，您一下子改变了这么多的内容，谱图出现了变化，您能判断是因为哪个条件变化了引起的吗？原因不好查，方法上没有持续性，方法开发思路不是很清晰。
3. pH的变化对极性比较大的化合物，特别是容易电离的化合物的保留时间影响非常大，也因此常用于调节样品分离度的一个重要手段。您的流动相pH变化也是非常大，一下就从pH8变到了3.5，获得完全迥异的峰，甚至三个峰变得只剩下一个峰，这样没有持续性的变化不太好，如此说来您得到谱图就不让人感到意外了。
4. 一个建议：液相的工作需要耐心，该出来的峰得让它出来，你得尊重它的规律，不能太急。比如第一个图变成第二个图，流动相体系、pH变化这么多，多出来一个峰，从哪里来的就搞不清楚了。还有第二个图变成第三个图的时候，第三个图里面出现的最后一个峰在图3上都没出来，就因此判断这两个图上各自9min的那个峰是同一个峰，不对的，您把流动相比例改动了，图2上5min的那个峰其实就是图3上9min出来的那个峰；而图2上9min处的峰在图3上根本还没出来，但是您已经把液相停了。
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chqiu111111
第17楼2010/05/29
呵呵，谢谢哈！由于条件有限，所以红外和核磁都没有去做。波长的话我是通过扫描来确定的。我就想问一下，用DAD怎么判断纯度啊？我用TLC来判断，是因为老师之前说，只要TLC能显色出来的，斑点不同，说明肯定不是同一个物质，不懂我是否正确，请指点！也让我多多学习！谢谢了！
雪妖(czj_1027) 发表:z不愧是专家呀
真的是调理清晰明了
除了z说到的部分以外：
1、为什么不用别的方法，比如：红外或者核磁初步判断一下物质结构；
2、吸收波长是多少？是怎么确定的？是用紫外分光光度计将物质扫描一下，看看最大吸收在什么地方吗；
3、分离完全后，用DAD判断一下峰纯度了吗？看看是否是真的分离开了。
有个不太明白的地方，楼主用LC检测你的物质，目的是什么？是判断生成物质呢还是什么？
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zxhcnf
第19楼2010/05/31
能够获得最佳吸收波长当然最好了，如果事先没有办法测定最佳吸收波长，而又没有二极管阵列检测器的情况下，选择210nm可能会比较好，因为大多数的东西在这个波长下都会有吸收，乙腈和水的吸收波长都在200nm以下，所以建议用乙腈和水的体系，如果用甲醇和水的体系，甲醇会有比较大的吸收，本底会比较高，这样就降低了检测灵敏度，也有可能由于本底太高看不到所测化合物的峰。
chqiu111111(chqiu111111) 发表:首先感谢朋友的建议！
我想请问一下，为什么要首先选择210nm呢？依据是什么呢？我只知道我们应该选择最佳吸收波长。
恩，我会再试试你说的。