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yongzhbenq
第80楼2010/07/27
在做多肽类样品的时候，300A孔径的填料相对100A孔径肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点
流动相加入TFA，我从网上找了一些资料，看看能不能解释一下：
在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。
三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。
Applications for Trifluoroacetic Acid- Ion pair reagent for reverse-phase HPLC1-3
- Protein/peptide sequencing4-7
- Protein/peptide solubilizing agent4-7
- Solid-phase peptide synthesis8
- Amino acid analysis
- Making 0.1% solutions of trifluoroacetic acid (w/v vs. v/v)
References- Chicz, R.M. and Regnier, F.E. (1990) Methods Enzymol. 182, 392-421.
- Zarember, K.A., et al. (2002) Infect. Immun. 70, 569-576.
- Lassy, R.A. and Miller, C.G. (2000) J. Bacteriol. 182, 2536-2543.
- Smith, B.J. (1997) Protein Sequencing Protocols. Humana Press.
- Allen, G. (1989) Sequencing of Proteins and Peptides, Second Revised Addition. Elsevier.
- Backstrom, J.R., et al. (1996) J. Neurosci. 16, 7910-7919.
- Hermann, P.M., et al (2000) J. Neurosci. 20, 6355-6364.
- Stuart, J.M. and Young, J.D. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Second Edition. Pierce Chemical Company.
xingwangyang(xingwangyang) 发表:plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：我在做多肽药物时遇到下列问题
1. 基线不稳定波动大 流动相 A ：1％TFA水溶液 B:1％TFA乙腈溶液 检测波长210nm 流速：1.0ml/ml 什么原因？怎么解决？TFA有什么作用？
流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好。
2. 做完肽类样品时 怎么冲洗C18比较好？
3. 药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为30nm，30nm与10nm对结果有什么区别
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plexu
第81楼2010/07/27
反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：
流动相中不含缓冲盐
分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min流动相中含有缓冲盐
分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易长菌，使用时间不可超过3天）；
水性柱保存体系也不特别：短期保存在所用的流动相中（不含缓冲盐），中长期保存在纯甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。majinfei8(majinfei8) 发表:plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：waters Atlantis C18柱可以用较高比例的流动相，那麽用完后应该怎麽清洗？在什麽体系中保存比教合适？谢谢。
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yongzhbenq
第84楼2010/07/27
欧洲药典虽然规定了填料的粒径、柱长、直径等等参数，但并不是要求很死，可以在一定范围内调整
比如：Method Parameter Acceptable Modification Monograph 0703 Atenolol Kinetex 2.6 µm Fast Method Modification Mobile phase pH ±0.2 units 3 No change -- Concentration of salts in buffer ±10% As specified No change -- Ratio of components in mobile phase ±30% of the minor component(s), or 2% absolute of that component, whichever is greater, but a change in any component can not exceed ±10% absolute As specified No change -- Wavelength of UV detector no deviations permitted 226 nm No change -- Injection volume Increased to as much as twice the volume specified, provided no adverse effects—must be within stated linearity range of the method 10 µL No change -- Column temperature ±10° Ambient No change -- Column length ±70% 125 mm 100 mm -20% Column inner diameter ±25% 4.0 mm 4.6 mm +15% Particle size -50% 5 µm 2.6 µm -48% Flow rate ±50% 0.6 mL/min 0.9 mL/min +50% Table 1: Acceptable modifications for meeting system suitability (Source: European Pharmacopoeia guidelines)
Fully porous 5 µm Kinetex 2.6 µm C18 0.9 mL/min Kinetex 2.6 µm C18 1.3 mL/min Column dimensions 125 × 4.0 mm 100 × 4.6 mm 100 × 4.6 mm Particle size 5 µm fully porous 2.6 µm core shell 2.6 µm core shell Flow rate 0.6 mL/min 0.9 mL/min 1.3 mL/min Backpressure 168 bar 270 bar 380 bar Resolution of impurities J & I 1.95 3.72 3.65 S/N ratio for Impurity J 40 78.1 78.7 S/N ratio for Impurity I 12.3 30.2 28.7 S/N ratio for Impurity G 3.31 9.38 9.33 N of Impurity J 8,206 21,118 19,473 Elution time of last peak 33.3 min 11.9 min 8.0 min Table 2: Improvements to EP Monograph 0703 for Atenolol and related substances using core-shell particle technology results in a three- to four-fold reduction in analysis time and organic solvent usage. (Source: Phenomenex)
plexu(plexu) 发表:美国药典欧洲药典对填料和柱长并没有规定很死，是允许在一定范围内调整的，加保护柱肯定不违反药典的规定。
