我也觉得是柱子没有保留住样品

我觉得梯度洗脱的话一般是洗脱能力由弱变强，楼主这样由强变弱的梯度我不是很理解，是不是应该试试10:90甲醇水到100甲醇的梯度？
如果怎么也分不开的话，是不是反相色谱的方法不是很合适？是不是离子对或者调调pH会好些
总的来说楼主还是应该对要分析物质的性质有初步了解，不然考虑条件的话就有些茫然了吧

应该就是柱子的问题，既然你的样品不是单一物质，而你在梯度洗脱时只出现了一个峰，应该是柱子太短的问题，物质在柱子内的保留时间太短，还未达到分离的效果，就被流动相一起带出了柱子，你换一根4.6*250column 试试；另外你再查查相关文献，看看你用的流动相比率是否合适，问题解决了以后希望老兄能分享一下解决方案，感激不尽……

那当然，解决后肯定会分享一下，集体的智慧嘛

1、样品处理不合适
2、色谱柱不保留
3、梯度甲醇比例由小到大
4、用气相或反相试试

你那是什么类型的样品呀？打电话问问仪器厂商的应用工程师问问