连续 5d 口服给药后，甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的浓度随时间变化见表 6-5，经过非线性最小二乘法回归处理后，血液几个组织的药物浓度与时间关系的消除曲线方程可用下述数学表达式描述：

C血液=0.849e-0.494t ；C肌肉=1.461e-0.682t

连续 5d 口服给药后，甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为 1.016d和 1.403d。

AT在肌P+皮中肉度浓）μg/g（ 15mg/kg 30mg/kg

图 6-5 连续 5d 给药后 TAP 在鲈鱼血液中的浓度变化

Fig.6-5 The Concentrations (mean±s.d.)of TAP in plasma after the fifth of oral administration of 15

and 30m g/kg for five consecutive days

图 6-6 连续 5d 给药后 TAP 在鲈鱼肌肉+皮中的浓度变化

Fig.6-6 The Concentrations (mean±s.d.)of TAP in muscle+skin after the fifth of oral administrationof 15 and 30m g/kg for five consecutive days时间（day）浓（度g/g)n95%忍受区间

95%置信区间

图 6-7 15 m g/kg 连续给药后 TAP 在鲈鱼组织中的消除曲线

Fig.6-7 Elimination curve of TAP in L ateolabras j anopicus after the fifth multiple oral

administration of for five 15 m g/kg consecutive days

时间（day）

AP在血液T浓度（中g/mL）μ15mg/kg 30mg/kg江南大学博士学位论文

浓（度g/g）n95%忍受限95%置信区间最大残留量

图 6-8 30 m g/kg 连续给药后 TAP 在鲈鱼组织中的消除曲线Fig.6-8 Elimination curve of TAP in L ateolabras j anopicus after the fifth multiple oraladministration of for five 30 m g/kg consecutive days

在本研究中，连续 5d 口服 15 和 30 mg/kg 的 TAP，药物在血液中的浓度和服用剂量有很好的相关性，数据表明，在可测范围内，药物的吸收速率是一个常数，它在血液中的消除速率也是一个常数，这和单次口服结果一致。

Dlla Rocca 等[3] 在 1997 年的研究中发现：连续 5 天服用 40 mg/kg 的 TAP，药物在肌肉中的浓度和达到 1.97μg/g，药物在肌肉中的浓度低于 0.03μg/g 时，需要停药后 72小时。在本研究中，连续 5d 服用 30 mg/kg 的 TAP，药物在肌肉中的浓度和 Dlla a Roccaet al 的研究结果相似，但是药物的消除时间更慢。比较慢的消除速率导致了休药期 5 天（低剂量）和 6d（高剂量）明显比 Dlla Rocca et al 推荐的 3d 要长。

在本研究中，休药期是通过EMEA/CVMP/036/95所规定的统计方法[4]，而Dlla Roccaet al 所用的是选择方法。统计学方法是首选的计算休药期的方法，因为在鱼体动力学研究中，个体之间有很大的差别，为了保护消费者的安全，建立一个忍受限是非常重要的。

在连续 5d 口服 15mg/kg 和 30mg/kg 的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d 和 6.0d，因此分别选择了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期，在休药期以后，认为是安全的，可以作为食物消费。

6.3.8 影响药物代谢和残留的因素

1）温度

一般认为药物在组织中的消除速率主要有环境温度决定。在一定温度范围内,鱼体的代谢速率与水温成正比。温度升高 1℃,鱼的代谢活力增加 10% 。Namdari 等[5] 的研究表明,大鳞大麻哈鱼在 15℃和 9℃的最终持续消除率β值大约相差 60% 。Tyrpenou 等[ 6] 研究现, 25℃与 18℃水温相比，沙拉沙星在金头鲷肝脏和肌肉(带皮) 中的最高浓度明显较高，并且消除较快。Namdari 等[7]研究大鳞大麻哈鱼肌肉中 OTC 的分布和消除是消除时测得，水温在 12℃和 9℃下，肌肉中的 OTC 半衰期分别为 10.34 天和 13.59 天，差异明显。因此水温较低时停药期应该适当延长。

2）盐度

不同学者在盐度对药动学的影响方面看法不一。Hugtredt 等[8] 通过实验证明虹鳟在海水中代谢消除率较高,对药物的吸收与分布更快,在淡水中的表观分布容积比海水中略大。Noriko 等[9] 研究发现海水中虹鳟对于恶喹酸的消除明显较淡水中快。而 Abedini等[10] 研究得出盐度相差 24 并未对土霉素的吸收与消除造成较大影响，并且提出可以用淡水中的虹鳟作为一个模型，来研究海水中的虹鳟对土霉素的药物代谢情况，反之亦可。

3) 溶解氧(DO )及其他

对于 DO 对药动学的影响,有学者[11] 认为, DO 高,鱼类行为活跃，代谢旺盛；药物的吸收与分布速率加快,生物利用率也较高,综合药效较好。对于四环素类药物，由于易与二价或三价阳离子结合，水的硬度也影响到药物的吸收与代谢。当给鱼口服喂药后,药物不可避免地与水体中或鱼体内的 Ca2+ 、Mg2+ 以及 AL3+ 螯合,结合后的药物不易穿过细胞脂膜，吸收是不可能的，因此导致药物吸收的缓慢和不完全，消除速度也很慢。

4) 饵料因素

Hustvedt 和 Martinsen 等[ 12, 13, 14 ] 曾指出，口服药物的载体、投饵给药以及药物和饵料的结合方式,可能会改变峰浓度和达峰时间。例如饵料中的 Ca2+ 、Mg2+ 、Fe2+ 和AL3 + 等离子影响四环素类药物的吸收,并降低其生物利用度。

国外学者在水产动物药动学方面已作了较广泛、深入的研究,而国内则刚刚起步,在广度和深度上均远落后于国外。借鉴国外水产动物药动学研究方法与经验,对提高我国水产动物药动学研究水平十分必要。药动学的特征参数,如吸收速率、达峰时间、峰浓度、分布和消除半衰期、曲线下面积和总体清除率等是选择药物种类、制定用药剂型、剂量和用药周期以及确定休药期的重要依据，为药物的科学使用和水产品安全监控与管理提供理论指导,确保我国水产养殖业持续、健康、稳定发展。由于条件的限制，本论文只是研究了 TAP 在一个温度下在一种鱼类中的代谢消除规律，今后可以在以下几个方面加深研究： (1) 同一药物在不同的水产动物体内代谢动力学种属差异性研究； (2)研究环境因子(如温度、盐度、溶解氧等) 对水产动物药动学影响； (3) 比较研究水产动物健康与非健康水平时的药动学, 建立人工诱发疾病的水产动物药动学模型；(4) 进一步研究药物在水产动物体内生物转化及代谢产物在水产动物体内的代谢和消除规律；

(5) 深入开展水产动物药动学与药效学、毒理学的同步研究,全面评价药物在水产动物体

内的效用。

6.4 本章小结

1. 本章研究了样品中 TAP 的提取净化方法，分离提取简单，样品净化比较彻底，回收率都达到 85%以上，并且比较稳定；高效液相色谱分析谱峰分离良好，灵敏专一，表明此方法是可行的；

2. 鲈鱼单次口服 5 mg/kg 和 30 mg/kg 的 TAP 药物后，药物在血液中的达峰时间分别为 6 小时和 8 小时，在服药 36 小时以后，血液中的药物浓度还高于要求的最大限量（50ng/mL），药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系数是个常数。药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时，从而表明药物的消除速率不依靠药物剂量的服用的大小；甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程： C=10.812（e-0.087t – e-0.274t），鲈鱼口服甲砜霉素后，药物在鲈鱼血液中的吸收半衰期为 1.997h，消除半衰期为 5.589h；

3. 连续 5d 口服 15 和 30m g/kg 的 TAP，药物在血液中的浓度和服用剂量有很好的相关性，在可测范围内，药物的吸收速率是一个常数，它在血液中的消除速率也是一个常数，这和单次口服结果一致，其消除速率方程分别为

C血液=0.849e-0.494t ；

C肌肉=1.461e-0.682t，

甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为 1.403d 和1.016d。

4. 通过 EMEA/CVMP/036/95 所规定的统计方法计算休药期，在连续 5 天口服 15 mg/kg和 30 mg/kg 的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d和 6.0d，确定了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期，在休药期以后，认为是安全的，可以作为食物消费。第六章 甲砜霉素残留在鲈鱼体内的消除规律

一本书啊。不是我的专业，学习了

近年来，甲砜霉素在水产养殖中被广泛应用。现在甲砜霉素在欧盟属于受监控药物，

在日本属于被禁用药物。因此，如何控制 TAP 在水产动物内残留成了一个重要问题。

对残留实施监控是一种复杂的系统工程，包括从药物及剂型研制、注册登记、使用、食

品和环境监测等诸多环节。从理论和技术角度，建立最高残留限量和分析方法是最基本

的方面。前者是监控的依据，后者是监控的手段，二者共同构成了兽药残留监控的基础。

近年来，国内对甲砜霉素的检测方法只有气相色谱法，远远不能满足实际监控的需要。

本研究对水产品种甲砜霉素的残留检测方法进行了研究，建立了快速筛选的 ELISA 方

法 ，同时建立了高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用的方

法。在建立了仪器分析方法的基础上，采用高效液相色谱法，研究了 TAP 在鲈鱼血液

和可食性组织中的消除规律，制定了合理的休药期。

筛选分析法一般提供被测物是否存在或浓度是否超过MRLs的初步信息。对筛选分

析法只要求具有半定量和一定的定性能力，但必须灵敏度高、过程简单、分析速度快。

在此条件下一般不会出现假阴性结果，但假阳性结果的几率必然升高。通常可以认定筛

选分析法的阴性结果，但对阳性结果必须用确证分析法确证。本文建立的ELISA方法用

于水产品中TAP的检测，结果稳定，安全可靠。研究的结果初步显示，该方法是用于水

产品种的TAP残留快速检测。非常适合作为TAP残留的筛选方法。

为降低大批量样品分析的成本和提高分析效率，商检中通常将筛选分析法和确证分

析法组合使用，即所谓“两步”策略：首先用筛选分析法对大量样品进行快速分析；疑

似阳性样品再用确证分析法确证。根据这个原则，在建立了TAP残留的ELISA方法外，

本研究还建立了TAP残留的仪器分析方法，高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联

用的方法的方法可以作为确证方法，明确提供全部或补充的确证信息，避免了假阳性结

果。

在建立各种检测方法的同时，本文还对原有水产品中TAP残留的提取方法进行了研

究改进，对各种影响因素进行了研究，建立了一套高效提取甲砜霉素残留的提取分离净

化方法。甲砜霉素除了在水产养殖中广泛应用之外，在畜禽中也广泛应用，在畜禽中的

残留尚待进一步研究。

应用高效液相色谱法，研究了TAP在鲈鱼体内的消除规律。根据统计学方法，得出

了TAP在鲈鱼用药的休药期。但是药物在水产品中的代谢动力学受很多因素的影响，如

给药方式、种属不同以及水温和化学物质的影响，都能影响到药物在水产动物体内的代

谢。本论文只是研究了TAP在一个温度下在一种鱼类中的代谢消除规律，今后可以在以

下几个方面加深研究：

(1) 同一药物在不同的水产动物体内代谢动力学种属差异性研究；

(2) 研究环境因子(如温度、盐度、溶解氧等) 对水产动物药动学影响；

(3) 比较研究水产动物健康与非健康水平时的药动学, 建立人工诱发疾病的水产动物药动学模型；

(4)进一步研究药物在水产动物体内生物转化及代谢产物在水产动物体内的代谢和消除规

律；

(5) 深入开展水产动物药动学与药效学、毒理学的同步研究,全面评价药物在水产

动物体内的效用。

综观全文，TAP 残留的 ELISA 检测方法的研究是涉及多学科多领域的交叉性课题。

它包括生物合成技术，免疫技术，生物标记技术，提取分离净化技术等。本文对这几个

方面都进行了系统的研究，建立了快速简便的 TAP 残留检测技术。酶免疫检测技术最

显著的特点是对酶促反应与免疫反应进行了有机的统一。但是对酶免疫检测动力学的研

究非常少，主要是因为这方面的研究非常复杂。但是如果能够研究清楚了动力学方面的

机理，可能大幅度的提高免疫检测技术的发展，这一方面有待以后研究。主要结论

主要结论

1. 通过酯化反应，合成了 TAP 酯化产物，HPLC/MS 鉴定结果表明，获得产物就是应

得的 TAP 酯化产物；利用混合酸酐法合成 TAP-BSA 偶联物，构建 TAP 完全抗原

并进行鉴定。起始的摩尔比和合适的反应溶剂系统是提高偶联比和 TAP-HS 利用率

的主要因素。本实验起始摩尔比为 TAP-HS：载体蛋白 BSA 为 50﹕1，采用二甲基

甲酰胺 DMF 和 PBS（pH8.0） 溶液混合系统，所得偶联产物的偶联比为 1﹕12.5 ；

2. 通过免疫兔子，制备的到了抗 TAP 的特异性抗体，并且通过饱和硫酸铵沉淀，DEAE

柱层析和免疫亲和层析法对抗体进行了纯化。通过 ic-ELISA 方法对抗体的效价，

亲和常数和特异性进行了鉴定。抗体的效价达到了 1×106以上，亲和常数为 7.8×

10-9mol/L。抗体除与氯霉素有轻微的交叉反应外，无明显交叉反应；

3. 根据ELISA原理，通过实验，对实验条件行了摸索，选择了适合本研究的酶标板，

通过方阵法，测定了酶标二抗和包被抗原以及一抗的工作浓度分别为1﹕2000，1﹕

4000和1﹕200，建立了TAP在鱼体内残留的免疫检测方法；ELISA方法检测步骤和

使用试剂多，影响因素也就多。根据不同的影响因素对ELISA方法的影响，对这些

参数作了最优化处理，优化后的参数为：包被时间为37℃1h；封闭液选择了pH8稀

释0.2% 的明胶，封闭时间为37℃1h；温育时间为37℃2h；抗体工作液的浓度为

0.2mol/L, pH8.5;Tween-20的浓度为0.05%；二抗的反应时间为20分钟，显色时间为

15分钟；TMB储存液与底物缓冲液比例为1:4（V/V），TAP标液与抗体体积比为70

﹕30（V/V），建立了优化的ELISA检测方法；

4. 经过优化后，用实际样品进行检验，并对本方法进行了评估：灵敏度为 0.06ng/mL;

添加浓度比较低的时候，平行孔间的变异系数相对较大，但都在允许范围内(<15%)，

回收率也比较低。鱼血清的回收率在测定浓度范围内，不管高低，都在 90%以上。

而组织样品的回收率都比较低，特别是 1ng/g 时，更低。这可能是样品处理过程中

损失造成的。除了个别样品，大部分也还在可接受范围内(<20%); 试剂盒所采用抗

体针对 TAP 有交叉反应（TAP100％），抗体对其他抗生素类药物没有交叉反应；板

内 CV 要小于批内和批间 CV，所有 CV%都小于 15%；ic-ELISA 检测与 gc 比较，

检测结果相差重现性好，各个指标都达到了要求。经过保存实验，经过三个月后，

试验的重复性很好，标准曲线重现性好；

5. 建立了甲砜霉素的 HPLC，LC/MS，gc/MS 三种检测方法，甲砜霉素的回收率分别

为：HPLC 为 78.6～95.4% ；HPLC/MS 为 72.6～99.8%；gc/MS 为 85.6～101.5%，

相对偏差均小于 10% 。以信噪比的三倍为检出限，计算得出三种仪器的检出限分

别为：HPLC 为 8.3μg/kg；HPLC/MS 为 0.1μg/kg；gc/MS 为 0.1μg/kg；

6. 鲈鱼单次口服 5 m g/kg 和 30 m g/kg 的 TAP 药物后，药物在血液中的达峰时间分别
为 6 小时和 8 小时，在服药 36 小时以后，血液中的药物浓度还高于要求的最大限

量（50ng/mL），药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系数

是个常数。药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时，从而表明药物的消

除速率不依靠药物剂量的服用的大小；甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级

吸收二项指数方程：C=10.812（e-0.087t – e-0.274t），鲈鱼口服甲砜霉素后，药物在鲈

鱼血液中的吸收半衰期为 1.997h,消除半衰期为 5.589h；连续 5 天口服 15 和

30mg/kg 的 TAP，药物在血液中的浓度和服用剂量有很好的相关性，在可测范围内，

药物的吸收速率是一个常数，它在血液中的消除速率也是一个常数，这和单次口服

结果一致; 其消除速率方程分别为 C血液=0.849e-0.494t ；

C肌肉=1.461e-0.682t，甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为 1.016d 和 1.403d。

7. 通过 EMEA/CVMP/036/95 所规定的统计方法计算休药期，在连续 5d 口服 15mg/kg

和 30mg/kg 的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d 和

6.0d，确定了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期，在休药期以后，

认为是安全的，可以作为食物消费。

主要创新点

1. 根据ELISA原理，以抗TAP多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG (HRP-IgG)

为酶标二抗，对实验条件行了摸索，建立了TAP在鱼体内残留的免疫检测方法；根

据不同的影响因素对ELISA方法的影响，对这些参数作了最优化处理，经过保存实

验，经过三个月后，试验的重复性很好，标准曲线重现性好；

2. 建立了甲砜霉素的 LC/MS，GC/MS 检测方法，甲砜霉素的回收率分别为 HPLC/MS

为 72.6～99.8%；GC/MS 为 85.6～101.5%，相对偏差均小于 10% 。以信噪比的三

倍为检出限，计算得出仪器的检出限分别为： HPLC/MS 为 0.1μg/kg；GC/MS 为

0.1μg/kg。

3. 鲈鱼单次口服 5 mg/kg 和 30 mg/kg 的 TAP 药物后，药物在血液中的达峰时间分别

为 6 小时和 8 小时，药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系

数是个常数。药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时；甲砜霉素在鲈鱼

血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程；在连续5d口服15 mg/kg和30 mg/kg

的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d 和 6.0d，确定

了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期。

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