Western Blot试剂的准备

1. 30%储备胶溶液：
丙烯酰胺（Acr） 29.0g
　　　　　　　　　　　亚甲双丙烯酰胺（Bis） 1.0g
　
混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。

2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl PH 8.8） Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。

3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8） Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。

4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。

5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）： Tris 15.2g
甘氨酸 94g
ddH2O 定容到1000ml
SDS 5g
　　先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。

6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。

7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液
　　　0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml
　　　10%SDS 4 ml
　　　β-巯基乙醇 1ml
　　　甘油 2ml
　　　1%溴芬蓝 1ml
　　　置4℃避光保存

8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用

9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：
即1×SDS-PAGE

10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ： NaCl 8.5g
　　　　　　　　　　　　　　　(12H2O)Na2HPO4 2.9011g
　　　　　　　　　　　　　　　(2H2O)NH2PO4 0.24g
　　　　　　　　　　　　　加ddH2O定容至 1000ml

11. 封闭液: 1×PBS中加入 30ml
　　　　　　　　　　　5%（V/V）脱脂奶粉 1.5g
　　　　　　　0.02%叠氮钠 0.006g
　　　　　　　0.05%Tween-20 0.015g

12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液
　　每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-20

13. 水饱和正丁醇：
正丁醇 50 ml
　　　　　　　　　ddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
　　用时取上面一相加在凝胶上面。

14. 考马斯亮蓝染色法试剂：一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）
染色液： 90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）
　　　　　　　　　脱色液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液

15. 丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，
　　　　　　　　　　　　　0.5%丽春红的水溶液
　　脱色液：TBS

16. Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。

17. PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。

18. 显色液：联苯胺显色液（DAB）
　　　　　DAB 2ml
　　　　　10%H2O2 60μl
　　　　　PBS(0.1mol/L PH6.4) 10ml

19. 三去污裂解缓冲液
0.5mol/L Tris-HCl(PH 8.0) 0.785g/100ml
0.15mol/L NaCl 0.8775 g/100ml
0.02%叠氮钠 0.02 g/100ml
0.1%SDS 0.1 g/100ml

1.5 mol/L Tris (PH8.8)

1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．用浓盐酸调节pH值至8.8。

4．定容至1L.

5．高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

（参照kara公司Catalog-N1）

1 mol/L Tris (PH6.8)

1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。

2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。

4．定容至1L.

5．高压灭菌后，室温保存。

注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。

30％丙稀酰胺（100ml）

1．称量下列试剂置于烧杯中。

2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。

3．定容至100 ml, 用0.45 µm滤膜滤去杂质。

5．于棕色瓶中4oC保存。

注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

10％ SDS

1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。

2．加入约70 ml去离子水，68oC加热溶解。

3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。

4．定容至100 ml，室温保存。

（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

10％过硫酸铵

1．称量1 g过硫酸铵。

2．加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。

3．储存于4oC。

注意：10％过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。

（参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）

1×SDS凝胶加样缓冲液

不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。

（参照《分子克隆》二版P884）

本人将参照此配方，配成5×或6×，各成分浓度均扩大5倍。

另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS－PAGE Loading Buffer配方：

组分浓度：

配制量 5 ml

配制方法

1．称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。

2．加去离子水溶解后定容至5 ml。

3．小份（500 ul/份）分装后于室温保存。

4．使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。

没有做过，受教了。