污染来源及鉴别

一、污染来源

细胞培养过中污染的来源有以下几条途：

1、不洁的动物组织本

很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但由取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造细胞污染。

2、空气

空气中含有大量的微生物，如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下，很容易造污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易造污染。

3、清洗消毒

培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。

4、操作

来自操作者的污染主要有以下几方面：

（1）器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末重新处理。

（2）操作者未戴口罩、帽子，呼出气中排出细菌和支原。

（3）培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。

（4）操作者不当心，动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等。

（5）操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等。

5、血清

市售血清灭菌不彻底，潜在病毒和支原体污染。

二、污染的鉴别

1、细菌、真菌污染的检测

（1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

（2）镜下观察 在倒置显微镜的倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

（3）接种观察 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发是否有污染。

2、支原体污染的检测

（1）相差显微镜观察 将细胞接种事先放置培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原在镜下呈暗色微小颗粒，多位细胞与细胞之间，有时可见类似布朗运动的表。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒等相区别。

（2）低涨处理地衣红染色观察 取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配的Carnoy液固定两次，每次10分钟，取出盖片凉干。用培养液时，先吸取1mL，500～800r/min离心5分钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分钟，加入Carnoy液固定，离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物，2～3张涂片。然后用2%醋酸依地红(地衣红2g，冰醋酸60mL，加蒸馏水至100mL)染5分钟。纯酒精过三次，每次1分钟，封入Euparal或树胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色，再封片。镜下观察见支原呈暗紫色小点，位细胞外或细胞之间。

（3）荧光染色法观察 用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配)中染色10分钟，置蒸馏水漂洗1～2分钟，向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5滴pH5.5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原呈绿色小点，散在细胞周围或附细胞表面。

（4）电镜检测 若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形观察法（见第九章）。

（5）培养检测 将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原肉汤培养基（Sigma或北京生物品所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出。

污染的清除和预防

一、污染的清除

培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难重新得到，可采取以下办法清除。

1、使用抗生素

抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染后清除用药需采用大常用量5～10倍的冲洗法，加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理，每隔2～3日换液1次，传1～2代进行治疗。近年来有报道，4-氟，2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilin derivative,BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种抗生素单用或合用对杀灭支原有效。这三种抗生素均用PBS配250X浓缩液，-20℃保存备用，使用浓度Cip为10μg/mL，BM-1为10μg/mL，BM-2为5μg/mL。使用时先吸除污染的培养液，加入含BM-1的RPMI1640培养液，3天后再吸除培养液，加入含BM-2的RPMI1640培养液，培养4天，如此连续3个轮次，直至用33258荧光染色镜检证明已清除支原后，再加正常培养液培养传代3-4次。

2、加温处理

将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原，但对细胞有不良影响。所以在处理前进行预试验，摸索能最大限度杀死支原又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。

3、使用支原体特异性血清

用5%的兔支原免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原污染，特异抗可抑支原生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。

4、其他方法

除了上述去除污染的方法外，还有动物内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原污染，除非有特别重价值，一般均弃之重新培养。

二、污染的预防

预防是防止细胞培养过中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小度。一般预防可从以下几方面着手：

1、从物品、用品消毒灭菌着手

细胞培养所用物品清洗、消毒彻底，各种溶液灭菌除菌仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材定期清洁消毒灭菌。

2、从操作者做起

（1）操作者责任心强，细心稳重，操作技熟练。进无菌室前用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后好门，坐下来尽量少走动。工作开始先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先严格检查器材、溶液和培养物，不把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造大批污染。

（2）操作者动作轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

（3）操作时常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

3、防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时，所用器具严格区分，最好做上记便辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。

在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。

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