应助达人

1.配置高效色谱柱,以解决色谱柱本身填装问题，筛板堵塞或填料塌陷
2.降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
3.减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
4.减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
5.选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
6.适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
7.尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
8.排除样品污染
9.做好样品前处理
10.合适的样品浓度
11.注意流动相的ph值
12.合适的检测波长或质量
13.缓冲盐溶液及浓度的正确使用
14.排除柱头有污染；
15.合适的进样量；
16.柱外效应；
17化学或二次保留（硅羟基）效应；
对于气相色谱
1.载气的流速
2.分流比
3.程序升温的设置
4.进样量
5.进样口温度

三、峰形问题

峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的准确性。引起峰形异常的因素很多，柱外死体积引起峰形异常有个特点：对先出的峰影响大，对后出峰影响小；柱头塌陷、柱头和筛板污染会引起所有的峰形都异常，而硅醇基次级保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也会造成峰拖尾。色谱实践中，大部分的峰形问题都不是色谱柱的问题，仪器参数设定、色谱条件和方法正确与否对峰形有很大影响。
1. 峰后拖
常见的3种拖尾情况：

次级保留引起峰拖尾的机理解析：
反相色谱中，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾，原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。


反相填料表面有残余的硅羟基，具有一定的酸性，其pKa约为4.5～4.7。根据电离规律，流动相的pH－pKa>2即pH>6.7时，99％以上的硅羟基应该是呈离子状态的，即Si－O－ ，而pKa－pH>2即pH<2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99％以上的硅羟基应该是呈分子状态的，即Si－OH，但其极性仍然存在，即Si－Oδ－Hδ＋。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多。同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生强的静电作用而被推迟洗脱出来，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。

上图是填料表面的示意图，完全硅羟化的硅胶表面硅羟基浓度为8?mol/m2，由于空间位阻的作用，通常与C18硅烷基发生反应的仅达2～3.5?mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羟基反应，如图中的三甲基氯硅烷，使硅羟基中的氢变成了三甲基硅烷的一个惰性基团。三甲基硅烷还是比氢原子大得多，还是不能将所有的残余硅羟基的活性封闭掉。
相同的样品在不同品牌的柱子上产生拖尾的严重性不同，从填料合成的角度而言就是键合密度是否高、封尾是否彻底，高密键合和彻底的封尾能显著减少这种机会，获得良好的峰形。Welch公司Ulimate品牌的XB－C18、AQ－C18和Xtimate C18采取的就是高密键合和彻底的双峰尾工艺。

解决方案：
1）先检查样品是否过载，由于样品过载引起的峰形后拖不能通过改变色谱条件消除。如果发现过载，需降低进样量（包括进样体积或浓度），进样量越小，峰形越好，例子如头孢尼西钠的测定：

2）调节流动相pH
将流动相的pH调至比弱酸pKa小2以上，比弱碱pKa大2以上，可有效抑制易离子化待测物的电离，从而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的测定：

碱性化合物中，甲胺的pKa为10.64，那么在pH< 8.64的时候它是完全呈离子态的， 那么pH在2.5~8.64时，特别是pH6.7～8.64时，此时甲胺和硅羟基均以离子状态－NH3＋和Si－O－形式存在的，它们之间相互吸引的静电作用导致后拖，这就是为什么很多碱性化合物在pH 7.0的条件下容易产生拖尾的原因。而很多色谱柱生产商也因此以阿米替林（含－N(CH3)2，碱性比－NH2强）在pH 7.0的条件下来评价和比较不同色谱柱之间的优劣，该条件下的阿米替林的峰形越好说明封尾越好。而在pH<2.5的条件下，也仍然后拖，是因为－NH3＋足够强，即使硅羟基以分子状态存在也仍能够与Si－Oδ－Hδ＋中氧原子产生吸引作用，导致峰形拖尾。当pH>12.64，大于pKa2以上时，甲胺完全以分子状态形式存在，不会引起拖尾。

3）增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度：
流动相中加入缓冲盐，增强了流动相的离子强度，在－NH3＋等极性基团和硅羟基Si－O－之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会，有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。这种适合于碱性较弱（如氨基的N原子与强吸电子基相连），或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基，例子如高乌甲素的测定：



4）加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等
拖尾的产生是因为－NH2、－NHR、－NR2与硅羟基发生静电作用引起的，那么阻碍它们之间静电作用的途径，应该有两种，一种是占据硅羟基这个作用位点，另一种是占据－NH2、－NHR、－NR2这个作用位点。
在流动相中加入三乙胺，能显著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羟基。三乙胺的pKa为11.09，在pH<11.09－2＝9.09的条件下是以离子状态N＋H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64 硅羟基呈Si－O－离子态的情况下，N＋H(CH2CH3)3容易与Si－O－形成相对较强的静电吸引力。
加入三乙胺改善峰形的时候，有两点需要注意：1）三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤。pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，可能引起的其它问题，建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值。通常即使pH回调过后，由于三乙胺成为了固定相的一部分，保留时间也有较大变化；2）三乙胺在210nm处有比较强的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。
四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N＋H(CH2CH3)3的结构N＋(CH2CH2CH2CH3)4 ，这种结构也能有效的与Si－O－产生较强的静电作用，阻止氨基与硅羟基的接触，改善峰形。而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是，它在低波长范围的吸收比三乙胺弱。
流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好的改善峰形，其作用机理与三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不同，是通过与样品分子的作用来阻止样品分子与硅羟基的作用来改善峰形。


2．峰前延
峰前延发生的概率比较小，下面是三种前拖峰的表现形式：

造成前延峰的原因有多种，我们可依次逐一排查：
1）样品是否过载
降低进样浓度，看峰形是否有所改善。一般认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。
2) 检查是否是用流动相溶解样品
溶解样品的溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相强会发生峰前延。具体机理是：
正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布。样品溶液进样后到达色谱柱时间很短，应还未被流动相充分稀释，洗脱能力更强的样品溶剂的局部存在，将使部分样品被洗脱的速度加快，导致峰前延。

3）增加流动相中缓冲盐的浓度
增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前延。例如：注射用苦参碱的测定

4）流动相中加入适量的四氢呋喃
往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道和使用，但其机理似乎少人提及。通常所加入的量在5％以内即可，需要的时候可以加入更大的量。例子如下：

阿莫西林胶囊的测定
色谱柱：Ultimate AQ－C18，5um，4.6×250mm；
检测波长：254nm； 温度：室温28度；
流 速：1.0ml/min； 进样量：20ul；



5）升高柱温
升温有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖，但温度不宜太高，温度太高容易损伤色谱柱，特别是含有离子对试剂的时候，最好不要超过40度。

3．其它峰形问题
裂峰：


柱头污染和柱头塌陷都会造成裂峰，最常见的原因是筛板上颗粒物堵塞样品进入色谱柱不均一，只需反冲色谱柱将颗粒物除掉就可解决。

气相色谱峰形异常及解决方法

A所有组分峰变小
可能原因 建议措施
1.进样针缺陷 使用新针或无缺陷的针
2.进样后漏夜 判断漏夜点，维修之
3.MAE UP过大：分流比过大 调整气体流速和分流比
4.分析物质分子量过大，底挥发样品时 提高INJ。OVEN（主要柱子的最高使
样品的汽化温度过低，或柱温度低 用温度）
5 NPD被污染物（二氧化硅）覆盖 更换铷珠
6.NPD温度过高（使用或环境温度），气体不纯 更换铷珠：避免高温使用
7.不分流进样，分流阀关闭快：初始OVEN温高
8 检测器与样品不匹配
9.样品的挥发 调整样品的的浓度或选择合适的溶剂

B峰伸舌
峰伸舌多由色谱柱过载 减小进样量(可能需提高仪器的sensitivty
使用大容量柱子：提高OVEN，INJ温度：
增大气体流速
C峰高峰面积不重复
1.进样不重复，偏差大 自动进样器：加强手动进样的练习
2.其他峰型变化引起的峰错位，干扰
3.基线的干扰
仪器系统参数设定的改变 参数标准化，规范化
D负 峰
1 Detector有数据处理系统信号极性接反 信号连接倒置
2 TCD中，样品导热系数大于载气导热系数 选择数据处理中的“负峰处理”
3 ECD被污染，可能在正峰后跟随负峰 清洗ECD，更换之（若有必要）
E样品的检测灵敏度下降
1.色谱柱，衬管被污染，使活性物质灵敏度小将 清洗衬管：用溶剂（优级纯甲醇）清洗色谱柱：更换之（如有必要）
2.进样时样品渗漏（对易挥发物质更甚） 查找渗漏点
3 在splite汽化进样中，OVEN初始温度过高 用低于样品溶剂的初始温度；致使样品汽化后扩散加剧，导致撕沸点样品灵敏度下降 使用高沸点溶剂
F 峰分叉
1 进样过激，不稳定，形成二次进样 练习手动进样：使用自动进样器
2.色谱柱安装失败 重新安装
3 spliteless或柱头进样，样品溶剂的混合 使用相同的溶剂
4.柱子温度波动 修理稳控系统
5 spliteless进样，量大，时间长。希望用“溶剂 在毛细管色谱柱前端安装5米的去
效应“谱带浓缩时，溶剂的固定相的湿润性差 活化，未覆盖固定液的毛细管
溶剂将在柱子中形成几米长，厚度不等的溶剂带
破坏正常的浓缩，使峰拉宽分叉
J 峰拖尾
1.衬管，色谱柱被污染；有活性点 清洗，更换之 （如有必要）
2.衬管，色谱柱安装不党，存在死体积 注射甲烷，峰若拖尾，则重新安装
3.色谱柱柱头不平 用金刚砂切割，使之平
4.固定相的极性指标与样品分析不匹配 换匹配的柱子
5 样品流通路线中有冷井 消除路线中的过低温度区
6.衬管或色谱柱中有堆积切割碎屑 清洗更换衬管；切除柱头10cm
7 进样时间过长 缩短之
8.分流比低 增大分流比（至少大于20/1）
9.进样量过高 减小进样体积或稀释样品
10 醇胺，伯胺，叔胺和羧酸类易拖尾 用极性大的色谱柱；样品衍生处理
H保留时间漂移
1 温度变化 检查柱温箱的温度
2.气体流速变化 注射甲烷，测定载气线速度
3.进样口泄露 检查进样垫；判断其他泄露处
4.溶剂条件变化 样品，标准品使用相同的溶剂
5.色谱柱被污染 切除柱头10cm；高温老化，清洗
I分离度下降
1.色谱柱被污染 方法同上
2 固定相被破坏（柱流失） 更换之
3 进样失败 检查泄露，维修之检查吹扫时间
检查温度的适应性；检查衬管
4.样品浓度过高 稀释；减少进样量；用高分流比
H溶剂峰拉宽
1.色谱柱安装失败
2.进样渗漏
3.进样量高 提高汽化温度
4.流比低 提高分流比
5OVEN低
6 分流进样时，初始OVEN过高 降低初始柱温，使用高沸点溶剂
7.吹扫时间过长（不分流进样） 定义短时间的吹扫程序
基线问题
A基线向下漂移
1 新安装的柱子，基线连续向漂移几分钟 继续老化
2 检测器未达到平衡 延长检测器的平衡时间
3 检测器或GC系统中其他部分有沉积物被烤出来 清洗之
B 基线向上漂移
1.色谱柱固定相被破坏
2 载气流速下降 调整载气压力；清洗压力和流量调节阀
C噪音
1.毛细管末插入检测器太深 重新安装色谱柱
2 使用ECD，TCD气体泄露引发基线噪音 检查，维修气路
3 FID ，NPD ，FPD燃气流速或燃气选择不当 高纯燃气，调整流速
4.进样口被污染 清洗进样口；更换搁垫；更衬管中的玻璃纤维或硅烷化
5.毛细管色谱柱被污染 切除首端10cm；用溶剂清洗色谱柱；更换之
6.检测器发生故障 维修，更换之
7.检测器电路发生故障 联系生产商或维修机构（专业）
D Offset(基线位置的突然改变
1.电源电压波动 使用稳压器
2 电路接口处连接不好 检查，清洗其接口处，拧紧接口
3.进样口被污染
4.色谱柱被污染
5.毛细管末端插入检测器太深
6 检测器被污染
E毛刺
1 电磁干扰 关闭电磁干扰源
2.颗粒污染进入检测器
3.气路密封松动，气体泄露 拧紧松动的密封
4.检测器内部电路接口或输入，输出信号接口松动 检查，清洗，拧紧接口，更换之
积尘或被腐蚀
F Wander（低频率的噪音）
1.温度，压力等环境条件的波动 找到环境因素变化与基线的关系，然后稳定之
2.温度控制漂移 测量检测器的温度
3 载气中含杂质（温度稳定时） 更换载气或气体净化器
4.进样口被污染
5.毛细管被污染
6.气体流速控制失灵 清洗或更换气体

高效液相色谱峰型异常问题
峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。
1、色谱图中未出峰。解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。
2、
一个峰或几个峰是负峰。解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。
3、
所有峰均为负峰。解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。
4、所有峰均为宽峰。解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。
、
5、所出峰比预想的小。解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。
6、出现双峰或肩峰。解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。
8、拖尾峰。解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。
9、出现平头峰。解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。
10、出现鬼峰。解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。

以上内容只是对液相色谱中出现的常见的问题进行了分析，在故障排除时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，确定假定因素与问题之间的联系；如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，避免浪费；这是成功进行故障排除的关键。总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养。

找不出来了，应该就这么多啦，差不多时间吃饭了。

从哪些方面入手?

1)仪器原因：好峰型检测仪器是最大的关键；
确定好仪器后再考虑其它诸如：检测波长、流动相组成、柱子型号、柱温度等
2)前处理：好的峰型要尽量去除杂质峰干扰；要选择去除杂质好的前处理设备、试剂等；
3)检测人员：我指的是经验，好的检测人员能实时调整仪器参数，得到好的峰型；

应助达人

大M太强了
不给你一颗星就说不过去了

都是大华和大M的天地啊，大华太强了，大M也不甘示弱