楼上说的差不多齐了，但是个人觉得4、5步骤之间时间太短，梯度洗脱中不建议流动相做瞬间剧烈变动，有机相剧烈变化的话压力变化较大，对仪器不太好。建议时间加长，比如把第5步时间改成18或19分钟

应助达人

我也做过这个标准。一瓶甲醇一瓶乙酸铵，我们没调PH也挺稳定。多平衡一会试试

谢谢，我今天重新配过流动相再试试，感激

谢谢，我确实是没有设置后运行，今天再试试

bingwang228版主说的5分钟，应该是waters或agilent的仪器，如果是岛津，起码要10分钟。

应助达人

是的，waters仪器上后运行5min就可以了，保留时间重复性很好

前段时间正好做了这个标准，感觉还是比较稳定的，可能出现问题的地方我说一下，楼主自己看看有没有说中什么吧。
一个是两次进样之间一定要有充分的平衡，也就是用初始流动相体系置换末状态流动相体系，这个很多朋友都说了。要注意的是这个平衡时间主要取决于你所用的色谱柱和混合阀体积，两次进样之间平衡充分是必须的。
这个体系中你在水相中加少量甲醇是可以的，这样可以减少两相混合时产生的气泡，对体系稳定是有帮助的，但是要注意在这种情况下要适当调整流动相梯度。
本方法中流动相pH对样品分离影响非常明显，照搬国标方法有两个样品是不能完全分离的，优化后可以实现所有样品完全分离。这从侧面反映了体系pH值对出峰时间影响明显，在这一体系中乙酸铵的浓度变化是可能影响出峰时间稳定性的。
不知道你有没有使用柱温箱？现在早午晚温差比较大，如果不使用柱温箱实验室也没有开空调，那么随着室温的上升样品保留时间会有明显改变。

根据多次进样后样品保留时间的变化规律一定程度上可以判断保留时间异常的原因，如果只是第一针和第二针有区别后面正常，那是没有问题的。

除了这些问题外常见的造成保留时间不稳的问题如泵头有气泡，单向阀失灵，漏液等都可能引起样品保留时间的异常，梯度中还要考虑梯度稳定性的问题。

另有一点在你做色素的时候要注意，样品在塑料离心管中有严重吸附，会造成出峰比较晚的几个峰高度不断下降，建议你用玻璃瓶配制样品，用前充分震荡。

亲，我在18分钟后设了1分钟做梯度过度，然后在用初始浓度走了7分钟，一共26分钟，问题解决了，接下来要学习数据处理了

乙酸铵里不用加甲醇，这样会导致保留时间不一致（因为甲醇会挥发，乙酸铵的浓度就改变了）。

低能度下挥发影响还是比较小的。