HPLC的主要分离方法-4.反相键合相色谱

反相高效液相色谱

在高效液相色谱中，反相色谱是应用最广的一类分离模式，占到高效液相色谱的70~80%。这其中又以反相键合相色谱最为普遍。

反相键合相色谱的优缺点：
① 样品极性范围宽, 有多种键合相可供选择；
② 大部分使用的极性溶剂-水流动相，平衡速度快；
③ 可用离子对或离子抑制技术分析离子或可离解化合物；
④ 容易操作, 分析速度更快, 重现性更好。
但应注意，对于硅基键合相, 流动相的pH应在2.5~7.0之间。pH<2.5, 键合相易脱落；pH>7.5, 硅胶可能溶解。

1 反相键合相固定相与流动相

一、反相色谱柱类型

反相色谱柱类型包括：
  a) 以硅胶为基质的反相柱（方框图展开，第二层）
    i. 常规硅胶键合C18，C8等填料柱
    ii. 对硅胶做碱性脱活的反相柱：适合分离碱性物质
    iii. 高碳覆盖量的柱：具有较高的保留值
    iv. 高稳定反相柱：可在较宽的pH范围内使用
  b) 以聚合物为基质的反相柱：特点是化学稳定性好，pH范围宽，但刚性不如硅胶
 苯乙烯-二乙烯苯共聚物
 高度交联的苯乙烯-二乙烯苯共聚物化学改性
 聚丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、聚乙烯醇类、苯乙烯和甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯的共聚物
 以其他氧化物为基质的反相柱：如二氧化钛和二氧化锆无机氧化物

二、反相色谱的流动相

反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。流动相的洗脱强度由有机强度的浓度和类型共同决定，这种影响见反相色谱溶剂强度图。

2 反相键合相色谱

一、反相色谱的分离机理---疏溶剂理论（Solvophobic theory）

疏溶剂理论的主要意思是：当一个非极性溶质或分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时, 会相互产生斥力, 自由能(DG)增加, 这是一个熵减少过程。为了弥补熵的损失, 溶剂分子中的非极性部分的结构取向将导致在极性溶剂中形成一个“空腔”。这种效应称为疏溶剂效应。

二、影响溶质保留的因素讨论

①流动相的极性（lnk’ ∝ γ）：降低流动相的表面张力，组分的保留值变小。通常，溶剂的表面张力与极性成正比。
在反相色谱中，水的表面张力最大。减少流动相中水的比例，即有机溶剂比例增大, 流动相的极性增大，表面张力下降, 保留值变小。

反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。关于溶质在反相色谱中的保留值与强溶剂浓度的关系，Snyder认为lgk与%B之间呈线性关系：  lgk=lgkw-SØ

② 烷基键合相链长（lnk’ ∝ AL (A项 )）（待链接一些色谱图）：实验表明，采用相同的流动相，溶质的保留值随着烷基键合相链长增加而增大。

③ 溶质的疏水特性（lnk’ ∝ AS (A项)）：大量实验证实，溶质的疏水性越大，保留时间越长。非极性化合物分子（或化合物中的非极性部分）表面积越大，其疏水性越大，在反相色谱中的保留值也越大。如
    ●  烷基苯同系物：苯，甲苯、乙苯、丙苯、丁苯等同系物，随着烷基链增长，保留值依次增大。
    ●  苯系物：苯、萘、蒽等多环芳烃，环数增大，保留值依次增大。
此外，在反相色谱中离子化合物不被保留；对于非离子化合物，极性大， 保留值值小；对于非极性部分相同的化合物，保留值随极性官能团增加而下降；对于几何异构体，能形成内氢键的异构体的化合物的保留值变大。 　

三、反相高效液相色谱的应用

反相高效液相色谱的应用十分广泛，是HPLC中应用最为普遍的一种模式，从一般小分子有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核甘酸、肽和分子量不大的蛋白质（小于50KD）。