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反相高效液相色谱
在高效液相色谱中,反相色谱是应用最广的一类分离模式,占到高效液相色谱的70~80%。这其中又以反相键合相色谱最为普遍。
反相键合相色谱的优缺点:
① 样品极性范围宽, 有多种键合相可供选择;
② 大部分使用的极性溶剂-水流动相,平衡速度快;
③ 可用离子对或离子抑制技术分析离子或可离解化合物;
④ 容易操作, 分析速度更快, 重现性更好。
但应注意,对于硅基键合相, 流动相的pH应在2.5~7.0之间。pH<2.5, 键合相易脱落;pH>7.5, 硅胶可能溶解。
1 反相键合相固定相与流动相
一、反相色谱柱类型
反相色谱柱类型包括:
a) 以硅胶为基质的反相柱(方框图展开,第二层)
i. 常规硅胶键合C18,C8等填料柱
ii. 对硅胶做碱性脱活的反相柱:适合分离碱性物质
iii. 高碳覆盖量的柱:具有较高的保留值
iv. 高稳定反相柱:可在较宽的pH范围内使用
b) 以聚合物为基质的反相柱:特点是化学稳定性好,pH范围宽,但刚性不如硅胶
苯乙烯-二乙烯苯共聚物
高度交联的苯乙烯-二乙烯苯共聚物化学改性
聚丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、聚乙烯醇类、苯乙烯和甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯的共聚物
以其他氧化物为基质的反相柱:如二氧化钛和二氧化锆无机氧化物
二、反相色谱的流动相
反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。流动相的洗脱强度由有机强度的浓度和类型共同决定,这种影响见反相色谱溶剂强度图。
2 反相键合相色谱
一、反相色谱的分离机理---疏溶剂理论(Solvophobic theory)
疏溶剂理论的主要意思是:当一个非极性溶质或分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时, 会相互产生斥力, 自由能(DG)增加, 这是一个熵减少过程。为了弥补熵的损失, 溶剂分子中的非极性部分的结构取向将导致在极性溶剂中形成一个“空腔”。这种效应称为疏溶剂效应。
二、影响溶质保留的因素讨论
①流动相的极性(lnk’ ∝ γ):降低流动相的表面张力,组分的保留值变小。通常,溶剂的表面张力与极性成正比。
在反相色谱中,水的表面张力最大。减少流动相中水的比例,即有机溶剂比例增大, 流动相的极性增大,表面张力下降, 保留值变小。
反相色谱中常用洗脱剂包括水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。关于溶质在反相色谱中的保留值与强溶剂浓度的关系,Snyder认为lgk与%B之间呈线性关系: lgk=lgkw-SØ
② 烷基键合相链长(lnk’ ∝ AL (A项 ))(待链接一些色谱图):实验表明,采用相同的流动相,溶质的保留值随着烷基键合相链长增加而增大。
③ 溶质的疏水特性(lnk’ ∝ AS (A项)):大量实验证实,溶质的疏水性越大,保留时间越长。非极性化合物分子(或化合物中的非极性部分)表面积越大,其疏水性越大,在反相色谱中的保留值也越大。如
● 烷基苯同系物:苯,甲苯、乙苯、丙苯、丁苯等同系物,随着烷基链增长,保留值依次增大。
● 苯系物:苯、萘、蒽等多环芳烃,环数增大,保留值依次增大。
此外,在反相色谱中离子化合物不被保留;对于非离子化合物,极性大, 保留值值小;对于非极性部分相同的化合物,保留值随极性官能团增加而下降;对于几何异构体,能形成内氢键的异构体的化合物的保留值变大。
三、反相高效液相色谱的应用
反相高效液相色谱的应用十分广泛,是HPLC中应用最为普遍的一种模式,从一般小分子有机物到药物、农药、氨基酸、低聚核甘酸、肽和分子量不大的蛋白质(小于50KD)。
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