锤子
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引言
药物代谢产物具有种类多,浓度低,样品基质复杂,内源性物质干扰严重等特点,同时由于代谢物与原药,代谢物之间结构类似,测定时亦造成相互干扰,一直以来代谢物物鉴定都占用了药物代谢工作者大量的时间和精力。近些年,随着质谱技术的成熟,单一功能的质谱仪已逐渐不能满足药物发现和开发阶段代谢物鉴定的需要,而复合型质谱仪集定量和定性于一身的强大功能能大大提高药物代谢工作者的工作效率,越来越受到用户的好评。2002年,AB Sciex公司独有的QTRAP复合型质谱仪的推出,将擅长定量的三重四级杆和优于定性的线性离子阱合二为一,并产生二者功能组合后的更为强大的功能,这是AB Sciex公司的又一次技术创新,是质谱技术发展史上的一次革命,是质谱史上具有里程碑意义的事件。从3200 QTRAP到4000 QTRAP,再到QTRAP 5500,QTRAP复合型质谱仪在扫描速度、灵敏度等性能方面完成一次又一次的突破和飞跃,成为药物代谢工作者的首选。
本文将从结合药物代谢研究的特点,从QTRAP复合型质谱仪的结构、原理、功能等方面,介绍它在药物发现和开发阶段代谢物鉴定方面的应用。
1. 药物代谢综述
1.1 药物代谢的定义、部位以及主要的代谢酶
药物代谢是指药物在体内吸收、分布、生物转化、排泄等一系列过程。药物代谢的主要器官是肝脏,也可发生在血浆、肾、肺、肠及胎盘。药物在体内代谢主要靠肝细胞微粒体的药酶,其中最主要的是混合功能氧化酶系。
1.2 药物代谢的类型
药物代谢可分为两种类型:第一类包括氧化、还原、水解等,产生Ⅰ相代谢产物;第二类为结合过程,药物分子或Ⅰ相代谢产物与体内活化的葡萄糖苷酸、硫酸酯、谷胱甘肽等结合,产生Ⅱ相代谢产物,产物一般水溶性加大,利于排泄。
1.3 药物代谢中常用的指导原则
在代谢物的鉴定中,根据MIST指导原则,仅在人的血浆中鉴定到的代谢物,或者在人体中的代谢物比其他任何种属的动物中都不成比例的高,这些代谢物应该考虑做安全评估;稳态时,超过全面暴露的母体药物10 %量的人体代谢物需引起安全关注。
1.4药物代谢的特点以及它对仪器的高要求
首先药物代谢产物具有种类多,浓度低,样品基质复杂等特点,首先对仪器的灵敏度要求非常高;其次,药物代谢产物尤其是真正的体内代谢产物还具有样品量有限的特点,样品量有限不能反复进样成为代谢物鉴定的瓶颈,这就要求仪器一针进样能给出更多的信息,显然单一型的质谱已经无法满足代谢物鉴定的高要求。
QTRAP复合型质谱仪,用其高灵敏度的三重四级杆以及高灵敏度的线性离子阱,一针进样同时给出定量定性数据,能够高效率的进行代谢物的定性、定量工作。另外具有三重四级杆和飞行时间质谱功能的TripleTOF5600复合型质谱,同样也可实现一针进样同时给出定量定性数据,数据信息量大,高质量准度和高分辨,使代谢物的检测工作效率有了突飞猛进的发展。(本文篇幅有限,仅介绍QTRAP复合型质谱仪)
2. QTRAP复合型质谱仪的结构和功能
在结构上,QTRAP复合型质谱仪在第三级质谱也就是Q3部分,既可以当作三重四级杆使用,又可以当作线性离子阱来使用,同时还可以在1 ms内完成从四级杆到线性离子阱的迅速切换,实现在一次扫描中从三重四级杆到线性离子阱两种质谱的互换,进而实现一针进样同时给出药物代谢产物定量定性图谱和数据。
在功能上,QTRAP复合型质谱仪具有三重四级杆的多反应离子监测 (MRM)、子离子扫描(Product Ion)、母离子扫描(Precursor Ion)、中性丢失扫描(Neutral Loss)等功能进行代谢物鉴定;还能够使用线性离子阱增强全扫描(EMS)、增强子离子扫描(EPI)、增强分辨率扫描(ER)、MS3等进行代谢物鉴定。由于线性离子阱的富集作用,也可以选择同时在Q0对离子进行富集,EMS、EPI的灵敏度与三重四级杆的全扫描和子离子扫描相比至少提高两个数量级以上,灵敏度的提高有利于发现浓度比较低的代谢物;MS3扫描在克服传统3D离子阱的1/3质量歧视效应的基础上,可以给出代谢物的三级碎片,有助于代谢物的结构鉴定和解析,选择母离子/子离子/三级离子定量,选择性强,也有助于复杂基质中代谢物的定量。
此外,QTRAP复合型质谱仪还具有IDA信息关联扫描功能(IDA,Information Dependent Acquisition)。采集方法可以运用多种预扫描确定进样MS/MS的候选离子,自动选择候选离子进MS/MS试验,根据动态排除能力进行循环试验,在一次扫描循环中可以实现三重四级杆和线性离子阱的循环切换,实现一机两用,定量定性同时进行。在一次进样中,就可以得到大量的代谢物的信息,成倍的提高效率,充分利用资源。
3. QTRAP复合型质谱仪在药物代谢物鉴定方面的独有方法和功能
1)QTRAP复合型质谱仪在代谢物鉴定的独有方法:
a.对于浓度比较高的药物代谢物,一般可以通过全扫描(EMS),全扫描关联增强子离子扫描(EMS-IDA-EPI)得到化合物的高灵敏度全扫描一级质谱图以及高灵敏度的二级质谱图。由于全扫描使用的是线性离子阱的功能,比四级杆扫描的灵敏度会有大幅度的提高,有利于代谢物的鉴定。
b.对于浓度比较低的代谢物,通过预测型多反应监测关联增强子离子扫描(pMRM-IDA-EPI)、母离子扫描关联增强子离子扫描(Prec-IDA-EPI)、中性丢失关联增强子离子扫描(NL-IDA-EPI)等方法检测,也可以根据实验需要几种扫描方式相辅相成,共同完成代谢物的鉴定。
2)pMRM
pMRM( predictive MRM)是进行药物代谢物鉴定的一种快速灵敏的筛选方法,是Analyst 软件的强大功能之一。由于MRM方式具有极高的灵敏度,这样就能够快速筛出低浓度的代谢产物,许多在全扫描模式下看不到的代谢产物,可以通过pMRM的扫描方式得到。它的原理是由于原药和代谢产物具有共同的母核,质谱的裂解规律也类似,所以只要知道母药的母子离子对,具此推测出Ⅰ、Ⅱ代谢产物的母/子离子,软件可以自动建立代谢产物的MRM离子对,再利用MRM-IDA-EPI得到代谢物的更全面二级图谱(MS/MS),更为方便快捷的判断药物代谢物的结构。
3)MIM和正负切换
对于非目标代谢物,常使用MIM和正负切换全扫描进行非目标代谢物鉴定的代谢物,鉴定时可通过MIM-IDA-EPI的方法。MIM(Multiple Ion Monitoring)法类似于MRM ,但不需要知道碎裂的信息,却具有与MRM相当的灵敏度和选择性。MIM方法具体是将Q1和Q3设为相同质量数,碰撞能量设置很小(可以将CE设为5),使母离子不碎裂,这样Q1、Q3同时选择,选择性强。
对于5500 QTRAP,在不损失灵敏度的前提下可实现正负离子迅速切换, 一次进样分析可同时检验酸性和碱性代谢物。
4)药物发现阶段的代谢物鉴定
对于药物的发现阶段,通过体外筛选得到主要的代谢物,此阶段化合物数目较大,预先得到很少的关于化合物信息,虽然灵敏度不是最大的关注点,但是要求质谱高通量,稳定性耐用性好,还可通过DicoveryQuant软件(简称DQ)来提高高通量筛选的效率。体外筛选的代谢产物主要为Ⅰ相代谢产物,通过体外代谢柔点分析,鉴定主要的代谢物。
5)药物开发阶段的代谢物鉴定
对于药物的开发阶段,生理学相关水平的体内代谢物浓度通常比较低,需要质谱有高的灵敏度;且代谢物的基质比较复杂,质谱的高选择性和耐用性也尤为重要。体内代谢产物既有Ⅰ相代谢产物也有Ⅱ相代谢产物。对于活性代谢物筛查,通常会采用中性丢失,如谷胱甘肽常用中性丢失129的扫描方式,反应活性的代谢物通常与与多种毒理活动有关。
4. QTRAP复合型质谱仪在代谢物鉴定方面的相关软件
通过LightSight代谢物鉴定软件来实现代谢物的快速查找和鉴定,更加方便,快捷,能大大提高代谢物的鉴定效率。
5. 结论
综上所述,QTRAP复合型质谱仪不仅具有三重四级杆多反应离子监测 (MRM)、子离子扫描(Product Ion)、母离子扫描(Precursor Ion)、中性丢失扫描(Neutral Loss)等功能,同时具有线性离子阱线性离子阱增强全扫描(EMS)、增强子离子扫描(EPI)、增强分辨率扫描(ER)、MS3的双重功能,并能产生1+1>2的组合功能,如全扫描关联增强子离子扫描(EMS-IDA-EPI)、多反应监测关联增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)、母离子扫描关联增强子离子扫描(Prec-IDA-EPI)、中性丢失关联增强子离子扫描(NL-IDA-EPI)等,从而实现一针进样同时得到定量定性数据,实现真正意义的定量、定性同时进行。
QTRAP复合型质谱仪实现了一台仪器,两类质谱,三种功能,是目前药物代谢物鉴定工作的主流产品,其集定量和定性于一身的强大功能大大提高药物代谢工作者的工作效率,在药物发现与开发阶段的代谢物鉴定中发挥着不可替代的作用,是药物代谢物鉴定的强有力工具。
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