荧光定量图像分析

激光扫描共聚焦显微镜不仅可以对生物样本进行二维和三维图像分析，还可以与荧光探针相结合，在图像处理的同时，进行图像定量分析。例如细胞面积及周长的测定和细胞核面积的测定，从而可以将生物体的形态学特征进行量化，提高了研究结果的准确性。激光扫描共聚焦显微镜能对单标记或双标记生物样品的共聚焦荧光定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化。根据实验要求设置好仪器测试的各种参数后，计算机便能自动进行数据采集，并将结果储存起来，供以后分析和输出。定量图像分析结果的表达有数字、直方图和二维坐标形式等，将生物样品的平均荧光强度、背景荧光强度、面积、周长和形状因子像素点等显示出来，同时在一种方式中表达。 我国学者为了解肝病患者肝组织纤维化程度，应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光定量图像分析。他们先把经肝穿刺活检得到的肝组织实施免疫荧光组织化学染色，肝组织I、Ⅲ型胶原分别与荧光素标记抗体结合，被标记上荧光素。不同的荧光素被共聚焦显微镜中激光管激发后，荧光强度和荧光面积的变化可以被计算机分析，便能准确地量化肝组织纤维化程度。首先，使用激光共聚焦显微镜检测I、Ⅲ型胶原的荧光定量表达。 Ⅰ、Ⅲ型胶原以红、绿双色荧光通道扫描观察，绿色荧光的激发波长为488nm，在；30nm波长以上观察，红色荧光的激发波长为543nm，在；60nm波长以上观察。每张切片选取10个视野观察，并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与荧光面积。上述指标的荧光值＝平均荧光强度×平均荧光面积。研究结果显示：经FITC和TRITC免疫荧光双重染色的Ⅲ型胶原阳性表达为绿色荧光；I型胶原阳性表达为红色荧光。慢性肝炎、肝硬化患者Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达大量增加，在门管区、血管壁周围及炎性坏死区均可见到I、Ⅲ型胶原表达增加，并向肝小叶内延伸。分隔包绕肝小叶；肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的荧光定量、G-S分期积分和已检测的血清肝纤维化指标，如透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ型胶原C(n-—C)相关性分析得出结论：在慢性肝炎和肝硬化时，上述研究指标均呈显著相关性。由此说明此种方法的荧光定量分析能准确地量化肝组织纤维化程度，对患者的治疗和预后有指导性意义。