基因药物的前沿技术

广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，而通常说的狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列，主要的治疗途径是ex vivo（间接体内法），即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。除间接体内法外，还可以用基因药物进行直接体内途径治疗，这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段（包括DNA或RNA）；可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗（包括DNA转录水平和 mRNA翻译水平）。基因药物不但可用于治疗疾病，而且可用于预防疾病。这类基因药物治法简单易行，发展迅速，新型基因药物不断产生。本文将着重对效果比较肯定的基因疫苗、反义RNA药物、三链DNA药物进行讨论。 1　基因疫苗 　　 　　地球上彻底消灭的第一种人类疾病��天花是靠牛痘疫苗来实现的。疫苗已帮助人类抵抗了多种传染性疾病的侵袭。但是，死疫苗不能提供内源性抗原，需多次接种才能起到一般的免疫效果；减毒活疫苗往往存在毒力回升的危险；亚单位疫苗免疫性差；重组疫苗存在安全性等问题。基因疫苗在这种情况下于1993年应运而生。基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统，使之达到防病的目的。 　 1.1　基因疫苗的免疫方法 　 　　基因疫苗的免疫方法即基因疫苗的给药途径，目前使用的方法有以下几种： 　 　　1）裸DNA直接注射：将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内。这种方法简单易行。 　 　　2）脂质体包裹DNA直接注射：包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将 DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途径同裸DNA直接注射。 　 　　3）金包被DNA基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被 DNA的金微粒子高速穿入组织细胞。 　 　　4）繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法：选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转化细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放出质粒DNA。 1.2　基因疫苗的优越性与问题 　　 　　基因疫苗被称之为第三代疫苗，自1993年问世后，在短短的5年中发展迅速。它与传统的疫苗相比，具有以下显著的优越性： 　 　　1） 抗原基因在体内持续表达产生抗原，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果更可靠。 　 　　2） 对于易变异的病毒，可以选择各亚型共有的核心蛋白保守DNA序列作基因疫苗，产生跨株系的免疫保护反应，从而避免易变异病毒产生的免疫逃避问题。 　　 　　3） 一个质粒可插入多个抗原基因，即组成多价基因疫苗，故一种基因疫苗可免疫多种疾病。 　　4） 基因疫苗具有减毒活疫苗的免疫原性，但不会存在活疫苗的毒力回升的危险。 　 　　5） 基因疫苗的质粒DNA无免疫原性，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应，故可重复使用。另外，基因还不会受机体已有抗体的影响，可用于带母体抗体的婴儿。 　　 　　6） 对于毒性大、危险的病毒，以及难以提取抗原的疫苗，基因疫苗的制备相对安全，容易得多。 　　7） 基因疫苗制备简单，容易大量生产，且成本低。质粒DNA非常稳定，易于贮存和运输。 　　8） 使用方便，可以经多种途径给药，不需免疫佐剂等。 　 基因疫苗作为一类新型疫苗，还有一些方面不完善，在实际应用中还存在一些问题有待解决： 　　　 1） 安全性问题：基因疫苗一般不会整合到染色体基因组上，但不能排除少数质粒DNA 插入到染色体上，引起插入突变的可能性。不过目前的动物实验尚未发现发生插入突变的证据。 　　2） 免疫效率有种属个体差异：各动物之间的免疫效率不一样，这可能与不同动物细胞需要不同启动子有关。同种动物之间也有个体差异，免疫效率往往不能达到百分之百，这可能与抗原基因、给药方法途径、给药量有关。 　　3） 基因疫苗体内持续表达产生抗原蛋白，可能引发免疫耐受。 　　 　　4） 基因疫苗的免疫应答机制仍不清楚。 　 1.3　基因疫苗的应用 　 　　基因疫苗目前主要应用于传统疫苗无法对付的病毒性疾病和恶性疾病，如艾滋病、乙型肝炎、癌症等疾病的治疗和预防。 　 　　1）病毒性疾病：世界上第一例基因疫苗是用于治疗艾滋病的HIV基因疫苗。1996 年批准在健康人身上进行预防艾滋病的基因疫苗的I期临床试验。流感病毒不同株间保守性抗原基因疫苗对不同株的流感病毒可产生抵抗力，以防止易变异流感病毒的免疫逃避。乙肝病毒表面抗原基因疫苗、包膜蛋白基因疫苗均可诱发机体产生免疫应答。基因疫苗还被用于其他病毒性疾病的预防，如单纯疱疹病毒 、狂犬病毒、丙肝病毒感染等。 　 　　2）癌症：有人用癌胚抗原基因疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞反应来治疗癌症。 Plautz等也将MHC-I抗原基因疫苗治疗腺癌或纤维肉瘤也引发了对肿瘤的细胞毒性作用。 　　 　　3）免疫调节：在注射针对疾病的基因疫苗的同时，注射编码细胞因子或辅助因子的基因疫苗，有助于增强免疫应答，调节免疫反应方向或免疫反应类型。 2　反义RNA 　　 　　反义RNA指与mRNA互补后，能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达，具有特异性强、操作简单的特点，可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。 2.1　反义RNA治疗的基本方法 　　1） 反义寡核苷酸（反义ON）：体外合成10至几十个核苷酸的反义ON或反义硫代磷酸酯寡核苷酸序列，用脂质体等将反义ON导入体内靶细胞，然后反义ON与相应mRNA 特异性结合，从而阻断mRNA的翻译。 　　 　　2） 反义RNA表达载体：合成或PCR扩增获取反义RNA的DNA，将它克隆到表达载体，然后将表达载体用脂质体导入靶细胞，该DNA转录反义RNA，反义RNA即与相应的 mRNA特异性结合，同样阻断某基因的翻译。 　　 2.2　反义RNA的特点与问题 　 　　反义RNA用于基因治疗具有以下特点： 　　 　　1） 具有特异性强：只阻断靶基因的翻译表达。 　　 　　2） 安全性好：反义RNA只与特定mRNA结合，不改变基因结构，最终会被RNase水解，不残留。 　　3） 操作简单：反义ON可大量合成，反义RNA的DNA既可合成又可PCR扩增获得。 　 　　4） 靶基因范围广：适应于多种疾病，亦可同时用多个反义RNA封闭多个基因，有可能应用于多基因病。 　　 　　但是，反义RNA作为基因治疗的常规药物，还存在一些需要解决： 　 　　1） 反义RNA的选择设计难：反义RNA与mRNA亲和力、结合的特异性受结合位点两侧序列的二级或三级结构的影响。 　 　　2） 有副作用问题：副作用与反义ON的多聚阴离子性质有关，目前有人正在试图去除多聚阴离子性质，减少副作用。 　 2.3 　反义RNA的应用 　 　　反义RNA目前主要用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病等。 　 　　1）恶性肿瘤：用反义K-ras封闭胰腺癌、肺癌的K-ras癌基因，对癌细胞具有明显的抑制作用。用反义RNA封闭慢性粒细胞白血病的bcr-abl融合基因的表达，能抑制肿瘤细胞的生长。通过反义RNA抑制程序性细胞死亡的拮抗基因bcl-2可提高化疗药对 T淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用。反义bcl-2亦可阻碍非何杰金氏淋巴肉瘤的生长。 　 　　2）病毒性疾病：HIV的反式激活蛋白反应顺序（TAR）与TAT蛋白结合可促使HIV 转录，当用反义TAR封闭TAR时，可终止HIV的转录，现已取得体外抗HIV的效果。反义 RNA对麻疹病毒也有显著的拮抗作用。 　 　　3）其他疾病：用胞间粘着分子的反义ON治疗肠炎病人，70%的病人其症状得到控制。针对CMV的反义ON也用于治疗CMV-视网膜炎病人。针对血管平滑肌细胞增殖的生长因子的反义ON能预防血管成形术后的再狭窄。 　 3　三链DNA 　　 　　脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，来阻止基因转录或DNA复制，此脱氧寡核苷酸被称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（TFO）。为了与作用在mRNA翻译水平的反义RNA的反义技术相区别，将三链DNA技术称之为反基因技术。 　 3.1　基本方法与机理 　 　　设计合成15～40个碱基的脱氧寡核苷酸，按T.AT、C+.GC、G.GC、A(AT三碱基体规律与双链DNA结合，通常结合在蛋白识别位点处，形成三链DNA，干扰DNA与蛋白质的结合，如转录激活因子，从而阻止基因的转录与复制。 　　　 3.2　TFO的优点与问题 　 　　TFO用于基因冶疗时将有以下优点： 　 　　1） TFO所需剂量小，因为TFO是针对转录水平的DNA序列，而反义RNA作用的mRNA 是DNA信息的放大，故TFO作治疗时的剂量较反义RNA大为减少。 　　2） 具有较强的特异性，因为1～2个碱基的错配将导致三链DNA稳定性大大降低。 　 　　但是，TFO还有一些问题需要解决： 　 　　1） 稳定性不够，半衰期较短。 　　2） TFO必经与同聚嘌呤同聚嘧啶片段结合，但这样DNA片段在真核细胞很少。 　 3.3　TFO的应用研究 　 　　由TFO的稳定性问题没解决，故其应用研究尚处于实验阶段，如抑制淋巴瘤的 bcl-2基因、乳腺癌的HER2基因、肿瘤多抗药MDR-1基因的表达，也有人将TFO用于抑制HIV的整合。 　 　　总之，在ex vivo法基因治疗举步艰难之际，用基因药物进行直接体内治疗取得了实际性进展，为基因治疗带来了新的曙光。