氨基酸直接分析法原理及应用

提 要 本文介绍一种新型氨基酸分析方法—离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPIC-IPAD)，详细讨论方法的原理和应用，该方法与传统方法比较，无须进行柱后或柱前衍生反应，对氨基酸可以直接进行分析，灵敏度高，大多数氨基酸的最小检测限均小于1pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。 关键词：氨基酸，离子交换色谱-积分脉冲安培法 1 前言 较为经典的氨基酸分析方法是阳离子交换分离, 柱后衍生反应，紫外分光或荧光检测[1]。常用的衍生试剂有茚三酮（Ninhydrin）和邻苯二甲醛（OPA）。此外还有柱前衍生-反相分离，衍生试剂有AQC(6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl-carbamate)，FMOC(9-fluorenylmethylchloroformate)，Dabsyl(4-di-methylamino-azobenzene sulfonylchloride)，Dansyl等。这些方法的缺点是操作复杂和影响因素多，如柱后衍生需要柱后衍生反应的附加装置和衍生试剂；柱前衍生虽然克服了柱后衍生的一些缺点，但存在氨基酸衍生物的不稳定，衍生反应的副产物和试剂本身干扰等缺点[2]。本文将讨论的美国Dionex公司新近推出的氨基酸直接分析方法是基于阴离子交换分离，积分脉冲安培法检测，无需将待测氨基酸转变成可被检测的化合物的衍生反应。 2 方法原理 2.1 阴离子交换分离 迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。这些氨基酸的基本结构通式如下： H R—C—COO - NH3+ 氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这也是氨基酸分离分析方法的基础。氨基酸直接分析用疏水性薄壳型阴离子交换树脂为固定相，碱性溶液为流动相，阴离子交换分离，积分脉冲安培法直接检测。流动相由水、氢氧化钠和醋酸钠溶液组成。其中氢氧化钠不仅提供淋洗离子OH-，而且碱性pH条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ac-）对固定相的亲和力大于OH-，它对于极性较小，保留较强的氨基酸起“推”的作用。表1列出了分析氨基酸的典型梯度淋洗条件[3]。图1是常见氨基酸混合标准溶液的色谱图[3]。 2.2脉冲积分安培检测 在高pH溶液中，含有脂肪氨基（-NH3）的化合物可在金电极上被氧化，因此可用电化学法检测，然而由于金电极吸附待测成分的氧化产物以及金电极表面形成氧化层，金电极会很快失效。为了解决这一问题，发展的电化学检测醇类和含氨基化合物的脉冲电化学检测器，由三个不同的脉冲电位代替直流安培检测器中的加于工作电极上的恒定电位。较工作电位高的正电位用来除去金电极上被测成分的氧化产物。由于金电极本身会部分被氧化成氧化金，再加一个大的负电位，使氧化金还原到还原状态。该脉冲每0.5~1秒循环1次。Polta等[4]首次报道了氨基酸的脉冲电化学检测。在金电极上得到氨基的最大氧化电流所需的电位超过金表面氧化的电位，金电极表面氧化所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基线的不稳定性。为了增加氨基氧化时所产生的检测信号，抑制金电极氧化所产生的背景信号，1989年Johnson等人[5]引入了一个新的技术—脉冲积分安培。与脉冲安培相似，积分安培法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形，其不同之处是采样时的电位不是恒定的，而是在高-低值之间扫描。在高电位时，氨基和金的氧化同时发生。在高电位时所形成的氧化金在低电位时被还原。因为在低电位时金的氧化是可逆的，而氨基的氧化是不可逆的，因而来自金电极氧化的信号被大大抵消，由积分整个高-低循环的电流所得到的信号仅仅是被分析成分的信号。 检测氨基酸和氨基糖的积分安培波形与早期的波形相似，但首先用负电位为清洗电位，这样可较好地保持电极的清洁和活性，不会引起电极和信号的损失。在前述的脉冲安培法中，首先用高的电位为清洗电位，金电极的过量氧化会导致检测响应值的逐渐降低。经过对检测氨基酸和氨基糖的施加电位波形的优化克服了基线漂移，改进了线性、信噪比和长时间的重复性，而且不损坏金工作电极。（节选） 该文发表在《现代科学仪器》2001年第二期