免疫荧光实验的几个问题

1、问：做间接法免疫荧光染色，要怎么设置对照？ 参考见解：最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色。 （1）空白对照：如果你作的是石蜡切片的免疫组化，这一个对照必须有，目的是看自发荧光。脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。 （2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。 （3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。 2、问：免疫荧光：用免疫荧光方法做同样的内容，组织切片和培养细胞，两者操作过程中有哪些不同？ 参考见解：只是固定方法不同，细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。 （1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光。 （2）封片最好用甘油加0。5mmol/L pH9。0-9。5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明更亮。 （3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内缘性过氧化物酶。 （4）如果要做苏木素复染，可用盐酸溶液去除苏木素。 3、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤以及注意事项？ 参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光的双染。有些体会： （1）选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 （2）我的做法是两种primary antibodies同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。 （3）我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 （4）Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清，我的是10%的正常donkey血清。 （5）其余同一般操作。 4、问：我做乳腺组织的免疫荧光染色，结果用激光共聚焦显微镜看很好，有阳性信号，阴性对照组也没有荧光，但是拿到荧光纤维镜下看，我的阴性对照组一片绿，像非特异性染色，到底哪个结果才是真实的呢？ 参考见解：激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多，出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题，如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因，荧光显微镜没有问题，那就以共聚焦显微镜的结果为主。抗体分装、及荧光显微镜观察结果是否一定要在暗室中进行实验。