锤子
目的: 我们设计一种含有大量微反应池的PCR基因芯片,能对基因的重排,突变和缺失等基因变异进行检测。PCR基因芯片的关键问题是如何检测出来在微反应池内获得的极其微量PCR产物。本文应用一些临床病例的实例标本,观察能否在基因芯片上进行不同的荧光掺入pcr反应并根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异。 方法:制作以硅片为材料的PCR基因芯片。利用健康外周血,正常脐血DNA,X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)家系成员6人外周血DNA做PCR-SSCP,并测序确定。设计检测此点突变的Taqman探针进行荧光PCR反应,在芯片上进行同样的反应,与上述反应结果进行对照。利用4步位点特异PCR结合SYBR荧光染料初筛HLAA2,并在芯片上进行同样的反应,与上述反应结果进行对照。 结果:设计并制作了有192个微反应池以硅片为材料的PCR基因芯片。PCR-SSCP分析与测序确定X连锁遗传性铁幼粒细胞贫血家系两患者的ALAS2基因第5外显子有G514A点突变,母亲、外祖母为杂合子携带者。设计taqman探针对此家系中六位成员DNA与二份正常男性脐血DNA检测与预期结果相符。将上述结果中同样的样本移入芯片进行PCR反应,结果与常规荧光PCR反应的结果一致。SYBR荧光染料PCR反应与芯片上SYBR荧光染料PCR反应的结果与预期完全相符。 结论:利用TaqMan探针与SYBR Green荧光染料可以在PCR基因芯片上顺利进行PCR反应,根据基因芯片上荧光的变化检测出点突变与单核苷酸多态性。为基因芯片的临床应用打下了基础。 .关键词: PCR基因芯片;荧光PCR反应;Taqman探针;荧光染料; 基因芯片技术具有快速多样、微型化和自动化[1~4]等特点在生物医学领域广泛的应用。但由于其基本原理是基于核酸杂交技术,有着内在的缺陷[5-6],实验的敏感性和重复性都存在一定问题。核酸杂交较适合于检测基因的表达,不易检测基因组DNA的基因的重排,突变和缺失。而大多数肿瘤性疾病和一些遗传变异和表型的改变与后者有关。为了解决上述问题,我们将芯片技术与荧光PCR技术相结合,设立设计一种含有大量微反应池的PCR基因芯片,以期能快速、准确的对基因的重排,突变和缺失等基因变异进行检测。常规PCR反应产物的检测是电泳后观察获得基因片段的大小,PCR基因芯片的关键问题是如何检测出来在微反应池内获得的极其微量PCR产物。本文应用一些临床病例的实例标本,观察能否在基因芯片上进行不同的荧光PCR反应,如何根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异。 1 病例、材料与方法 1.1 基因组DNA标本 健康成年人外周血DNA,正常脐血DNA,X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)家系成员6人外周血DNA均获自北京大学第一医院,均签署知情同意书。XLSA家系中患者为兄弟两个,年龄分别为8、7岁,都在婴儿时即发现贫血。家中有一个健康的姐姐,在两兄弟出生前,母亲曾有多次男胎自然流产史。成熟红细胞形态呈典型的小细胞低色素性贫血,骨髓铁染色可见大量环形铁粒幼细胞。临床初步诊断遗传性铁粒幼细胞贫血。 1.2 PCR基因芯片的设计与制作[7] PCR基因芯片上制备大量微反应室,可以同时进行不同的PCR反应。采用单抛525mm厚硅片作为衬底材料。硅片常规清洗后,在10-50°C下生长800nm厚的湿氧热氧化层,作为第一层掩膜层。然后150nm厚的Si3N4低压化学气相淀积(LPCVD)在硅片表面,形成第二层掩膜。第一次光刻,RIE刻蚀反应室及其流道上的Si3N4;采用掩膜板2光刻反应室的图形, RIE和BHF刻蚀反应室表面的SiO2。KOH腐蚀反应室的硅至150 um,此时流道上的硅由于有足够厚的SiO2作为保护层,没有开始腐蚀。腐蚀掉流道上的SiO2,同时进行反应室及流道上继续SiO2的腐蚀, KOH腐蚀的速度为1um/min,芯片进行热氧化生长300 um SiO2,以增强其表面的亲水性,保证反应液可以在芯片内顺利流动。芯片通过PVC聚合物压合封闭。
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