重组DNA转化

目的： 在体外连接组装而成的重组DNA分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。通过实验学会重组DNA转化的最基本的操作以及如何提高转化效率的基本思路。 原理： 带有外源dna片段的重组体分子在体外构建成后，需要导入适当的宿主细胞内进行繁殖或表达出具有一定生物活性的蛋白。能够作为重组体转化的受体，主要有动物细胞、植物细胞、微生物细胞等。导入受体细胞的途径重要有转化（转染），显微注射和电穿孔等多种不同的方式。可以根据不同的受体选择不同的导入方式。一般情况下，细菌一类的原核生物和酵母这样的低等真核细胞可用转化方式导入，而高等动植物细胞则需采用显微注射或电穿孔来进行。 细菌表面通过CaCl2处理后，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面，双链DNA分子解链变成单链，单链DNA分子一条进入受体细胞内，另一条被降解。进入细胞内的单链DNA则复制成双链环状DNA，随同复制子同时复制，并被转录翻译。 仪器与主要试剂： （一）仪器 1．隔水式电热恒温培养箱 2．超净工作台 3．高速冷冻离心机 4．水浴锅 （二）主要试剂 1．LB液体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，用5mol/LnaOH调节PH值至7.4，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 2．LB固体培养基：在配制的液体培养基三角烧瓶中加入2克琼脂，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 3．抗菌素： （1）氨苄青霉素(A mp)用前在无菌试管中,用灭菌水配制,母液浓度为100mg/ml。 （2）链霉素（Str）用前在无菌试管中, 用灭菌水配制,母液浓度为50mg/ml。 4．100mmol/L CaCl2 溶液：称取无水CaCl25.6克，加重蒸水至500 毫升，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 5．50%的PEG6000溶液：称取50 克聚乙二醇6000加重蒸水溶解，定容至100毫升，103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 实验方法（用CaCl2制备新鲜的感受态细胞转化法）： 感受态细菌制备 （1） 挑取在平板上活化的菌落接种于2毫升LB培养液中，在370C培养过夜。 （2） 按1%挑取过夜培养菌接种于50mlLB培养液中，370C振荡培养2~2个半期小时（OD600约在0.2~ 0.4） 。 （3） 培养物放冰浴中冷却10分钟。 （4） 分装离心管中，40C5000rpm离心5min，收集菌体，培养液尽量倒干净。 （5） 把菌体悬浮于10 ml的100mmol/L CaCl2 溶液，置冰浴中20min，40C5000rpm离心5min，收集菌体。 （6） 再将菌体悬浮于1-2ml的100mmol/L CaCl2 溶液中，40C保存，12-24小时后即可作为感受态细胞进行转化。 转化实验 （7） 取200ml感受态菌，加入待转化的重组DNA（体积应小于10ml，DNA<50 ng）混匀后置冰浴中30min（一般同时要做阳性对照和阴性对照。阳性对照为加入已知量的未重组质粒DNA的感受态菌，用于检测转化效率。阴性对照为完全不加质粒DNA的的感受态菌，用于检测感受态细菌有无污染及检测抗生素的活性）。 （8） 放入冰浴中30 min，转入420C水浴90s，再冰浴1-2 min，加入培养液800ml，放370C振荡培养45min。 （9） 将适当体积已转化的感受态细胞均匀铺于平皿上。 （10）待平皿中液体吸收后，倒置平皿，于370C培养12-16小时可出现菌落。