聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA

聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。 PCR进行的基本条件是： （1）以 DNA为模板（在RT－PCR中模板是RNA）； （2）以寡核苷酸为引物； （3）需要4种dNTP作为底物； （4）有 Taq dna聚合酶。 PCR每一个循环由三个步骤组成： （1）变性　　加热模板DNA，使其解离成单链； （2）退火　　降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA所需扩增序列结合； （3）延伸　　在适宜温度下，Taq DNA聚合酶利用dNTP使引物端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。 每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35个循环后，目标DNA 片段可能性扩增可达235倍。 PCR的影响因素： （1）模板 单、双链DNA或RNA都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。为提高PCR反应的特异性，所加DNA模板量应作相应的调整，如克隆DN A（ng），染色体DNA（μg）， 待扩增片段（104拷贝数量）来作起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA的蛋白质。 （2）引物 引物是决定PCR结果的关键。引物的设计应遵循以下原则： ①引物的长度一般为18-25个碱基 ②G+C含量一般为40-60% ③碱基的随机分布 （3）反应温度和时间 　 PCR涉及变性、退火、延伸三个不同温度和时间。通常变性温度和时间为95℃，45秒至1分钟，过高温度或持续时间过长会降低TaqDNA聚合酶活性和破坏dNTP分子。退火温度可选择比变性温度（Tm ）低2-3℃，变性温度按Tm =4（G+C）%+2（A+T）%计算。在Tm 值允许的范围内，较高的退火温度有利于提高PCR特异性，退火时间一般为0.5-1分钟。延伸温度为72℃，时间与待扩增片段长度有关，一般1Kb 以内片段延伸时间为1分钟，如扩增片段较长可适当增加时间。 （4）Taq DNA聚合酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应：从噬热水生菌中提取的天然酶和大肠杆菌表达的重组TaqDNA聚合酶（Ampli TaqTM ）。两种酶都有5’-3’外切酶活性，但均缺乏3’-5’外切酶活性。在PCR中，它们可以相互替代，催化典型的PCR所需酶量为l～2.5单位。酶量偏少则PCR产物相应减少，酶量过高则会增加非特异性反应。 （5）dNTP浓度 dNTP在饱和浓度（200 μmol／L）下使用。由于 dNTP溶液有较强酸性，配制时可用 l mol／L NaOH溶液将其贮存液（50 mmol／L）的 pH调至 7.0～7. 5。分装小管于-20℃保存。过多冻融会使其降解。 （6）PCR缓冲溶液 在反应体系中二价阳离子的存在至关重要，镁离子优于锰离子，而钙离子无效。它对引物与模板的结合、产物特异性、错配率、引物二聚体的生成及酶的活性等方面有较大影响，镁离子浓度一般在 0. 5～2. 5 mmol／L之间。每当首次使用靶序列和引物的一种新组合时，尤其要调整Mg+2浓度至最佳。 本实验从小鼠肝脏中提取的基因组DNA中扩增β-actin基因，其片段长度为800 bp。 【器材】 PCR扩增仪、掌式离心机、0.5ml PCR 管 【试剂】 1．PCR扩增试剂盒 2．引物1：5ˊATCTGGCACCACACCTTCTACAATG 3ˊ 引物2：5ˊCGTCACACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC 3ˊ 3．标准DNA：DL 2000 【操作步骤】 1.在0.5ml PCR塑料管中加入下列物质，并混匀。 10×PCR buffer(free Mg +2) 5μl