紫外吸收法测定DNA含量的实验方法

(一)原理 组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的浓度。 分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA。或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。对于很稀的溶液可采用荧光光度法。 (二)操作 取DNA样品作适当稀释，配制成5~50ug/ml的溶液，用紫外分光光度计测定260nm处的光密度值(OD260)，按下列公式计算，求出该样品的DNA含量。 DNA浓度(ug/ml )=OD260/0.02×L×稀释倍数 (L为比色杯的厚度(光径)，一般为1cm。)