PCR用于进化分析

通用引物 　　初看，对序列了解得不够好象限制了PCR的应用，因为对序列的某些了解是设计 PCR引物所必需的。幸好，有一种获得新物种引物序列的快速方法。通过选择广泛保 留在不同物种中的序列，可设计出通用引物，用于扩增一个特定细胞核或细胞器的基 因片段，此基因片段可取自一个较大类群的绝大多数成员，如：植物或真菌。这就把 系统发育的序列比较分析范围扩展到了纲或门的分类水平上。而且此法对鉴定标本和 划分生物类型在种群中的位置起重要作用。基于这些目的，线粒体DNA（mtDNA）序列 较适用。下面，我们详述对于细胞核及线粒体序列均适用的通用引物。线粒体基因法 是一个精确的检测方法；因为mtDNA进化非常快，设计此分子的引物会发生困难。 核基因引物 　　撏〝引物的概念在大量的_°?_RNAs直接测序中已使用多年。那些相同的引物极易 配对，通过pcr扩增核糖体DNA序列。rDNA扩增具有几个超过rRNA直接测的优点。首 先，DNA可作为起始物质，而用从组织中制备DNA比制备RNA容易。第二，样品用量更 少。最后，用各种测序酶及技术进行的DNA测序可用来从两链上获得数据并绕过核糖 体RNAs复杂的二极结构对其进行测序。 　　例如，我们设讦的引物可扩增许多真菌、原生动物、藻类、植物及动物的 18SrDNA上约515bp的片段（扩增区加引物约为555bp）。引物NS1和NS2的设计依据为 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、Dictyosteliumdiscoideum和 Stylonichiapustulata 18S rDNA 中的保守核苷酸序列，这在其它地方也有详述。