重组质粒的转化、筛选和鉴定操作

二、实验原理： 重组子的建立：采用双酶切 质粒 载体pBR322和pUC18,酶切后产生了互补的粘性末端,在T4 DNA 连接酶的作用下,两个质粒片段连接. 感受态细胞(Competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) . 转化(transformation)：是将异源DNA分子引入一 细胞株 系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞. 克隆的筛选：主要用不同 抗生素 基因筛选.常用的 抗生素 有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； 重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法. 最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析,对于带有LacZ基因的载体还可以结合α-互补现象来筛选.