食品中糖化酶的测定

实验二　糖化酶的制备 一、实验目的 学习并掌握黑曲霉发酵产生糖化酶的基本原理及操作方法。 二、实验原理 糖化酶又称葡萄糖淀粉酶 (glucoamylase, EC 3.2.1.3)，其作用方式不像α-淀粉酶那样无作用次序,而是从底物链的非还原性末端开始,顺次切下一个个葡萄糖单位,遇到分支处的α-1,6糖苷键时,可将α-1,6糖苷键切开,然后继续作用α-1,4糖苷键,直到产物全部成为葡萄糖为止。但糖化酶对α-1,6糖苷键的作用速度远不及对α-1,4糖苷键的作用速度，因此水解支链淀粉多的淀粉时，需延长水解作用时间或添加部分支链淀粉酶。 我国糖化酶的生产主要由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。本实验利用黑曲霉具有多种活力较强酶系的特点，利用淀粉类物质为原料，获得制备淀粉水解糖所需的糖化酶。 三、实验材料 1. 菌种：黑曲霉（Aspergillus niger） 2. 仪器：洁净工作台、灭菌锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机、高压灭菌锅 四、实验步骤 实验流程：保藏菌种菌株活化及平板扩大培养摇瓶培养 1.菌株活化及扩大培养 ①制备PDA培养基：去皮马铃薯200 g切成小块，加水约500 mL，煮沸30 min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20 g，琼脂20 g。溶化后加水定容至1000 mL，分装于250 ml锥形瓶中，121℃灭菌20 min，自然pH。 ②接种：取灭菌后PDA培养基倒平板，冷却后，接种斜面保藏的黑曲霉（Aspergillus niger）菌种，28℃恒温培养3d。 2.摇瓶发酵培养 ①发酵培养基的制备： 玉米粉培养基：玉米粉30g,米糠5g,麸皮5g,加水1000ml,拌匀至无干粉又无结团，分装于250 ml锥形瓶内，每瓶100 ml, 自然pH，121℃灭菌20 min。 ②接种与产酶培养:取培养72h的黑曲霉平板，用打孔器打孔制成菌片。每个锥形瓶中接种12片，28℃振荡培养96 h。 3.离心 将摇床培养4d的黑曲霉发酵液4层纱布过滤后离心（10000r/min，10min）除菌体，所得上清液即为糖化酶粗酶液。