Stellar高通量蛋白定量技术引领临床生物标志物检测新格局

赛默飞色谱与质谱

2024/10/22 13:58

李珊

生物标志物是指人体产生的某些生物分子，与正常状态相比，在疾病发展或药物治疗过程中表达量或受影响的程度不同。开展临床生物学标志物检测涉及疾病早期筛查、鉴别诊断、药物治疗监测及预后评估等疾病相关的各个环节。生物标志物的类型包括蛋白质、DNA、RNA 和代谢物等。其中，蛋白质生物标志物已经在治疗和诊断的发展中发挥了既定的作用。比如，急性炎症可以通过测量血液中C反应蛋白的水平来检测，癌胚抗原（CEA）可以在一些患者中指示结肠癌的存在。对于一些疾病，如肌萎缩侧索硬化症（ALS），没有测试可以提供明确的诊断，并且疾病症状与其它神经退行性疾病相似，蛋白质生物标志物有可能最终为患者提供答案。由于生物体的复杂多样性，更多的情况下，单一或少量的生物标志物往往无法反映机体的真实状态，更准确全面的评估需要结合更多生物标志物的检测结果。

在发现潜在蛋白生物标志物之后，需要通过靶向蛋白组学定量技术在大生物样本量中，进行高通量、高准确性、可重复性的检测，来验证这些标志物。目前，靶向蛋白定量检测技术主要包括免疫分析和质谱分析。传统的免疫法如ELISA，存在目标物通量低、灵敏度有限、交叉反应等不足，一些新型免疫检测平台则存在成本和技术门槛高、新方法开发周期长等问题。质谱靶向检测主要包括基于三重四极杆的多反应监测（MRM）和平行反应监测（PRM）方法。与MRM相比，PRM的优势在于它可以通过单次扫描即可监测目标母离子的所有产物离子，无需在数据采集之前预先设计母子离子对，简化了方法开发工作流程，并且可提高检测灵敏度。Heil等¹在Orbitrap Eclipse质谱仪上多次测量126个血浆蛋白中的432个肽，在高分辨率Orbitrap和单位分辨率线性离子阱（LIT）之间交替进行分析，发现两种质量分析器具有相似的技术精度，并且线性离子阱的优越灵敏度使其在超过62%的肽中测得更低的定量下限。

图1. Orbitrap与LIT PRM检测对比

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2024年ASMS大会上，赛默飞推出全新产品Thermo Scientific™ Stellar™质谱仪。Stellar可通过四极杆和双压线性离子阱进行PRM分析；其双离子阱结构允许同时进行离子积累和碎裂，可提高谱图采集速率，增加样本检测通量；并且可进行MS3采集，克服复杂背景基质干扰。

图2. 传统三重四极质谱计与Stellar质谱对比

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下面我们一起来看看Stellar发布以来在靶向蛋白质组学方向的应用研究报道结果。

Remes等²对比了血浆基质中786条多肽的三重四极杆和Stellar质谱靶向定量检测结果，发现与MRM检测结果相比，Stellar PRM检测的定量下限（LOQ）和检测下限（LOD）分别提高了~10倍和~2倍，展现出更高的灵敏度。

图3. MRM和Stellar PRM检测结果对比

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Plubell等³利用Orbitrap OE480或Stellar质谱建立基质样本GPF-DIA蛋白组学谱图库；通过集成在skyline软件中的PRM Conductor工具优化每个precursor的色谱和质谱参数，以及筛选precursor的m/z和相对保留时间；利用引入Adaptive RT功能的Stellar质谱仪进行筛选后precursors的PRM检测，开发了利用Stellar进行生物液体样本高通量靶向蛋白检测的方法（图4）。在神经退行性疾病病人来源的脑脊液样本中进行基于前期研究和GPF-DIA筛选得到的共101个蛋白（1070个precursors）的PRM检测，通过Tau、APOE4等明确与AD相关的蛋白检测结果验证了实验的可信度（图5）；另外对病人血浆样本进行直接基于GPF-DIA筛选得到的共723个蛋白（2096个precursors）的PRM检测，并成功验证出已报道的PD相关差异（图6）。

图4. 通过GPF-DIA建库和PRM conductor筛选precursors建立Stellar高通量PRM分析方法的工作流程。

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图5. 脑脊液样本中神经退行性疾病相关蛋白的PRM测定结果。

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图6. 建立富集血浆蛋白PRM检测方法发现帕金森疾病相关差异。（点击查看大图）

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Wahle等⁴开发报道了基于Orbitrap Astral的DIA数据建立Stellar PRM方法的分析策略（图7），以及利用¹⁵N标记蛋白在Stellar质谱上开发蛋白panel的准确定量方法（图8），使包括翻译后修饰和突变在内的蛋白质形态的研究成为可能，展示出Stellar在靶向蛋白质组学检测方面的能力和潜力。

图7. 基于Orbitrap Astral DIA数据建立Stellar靶向分析方法

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图8. 酒精肝panel蛋白¹⁵N标记检测

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小结

在蛋白质组学发现方面，Orbitrap Astral展示出强大的检测通量和覆盖深度，已经使开展大规模的临床样本检测、发现新的潜在生物学标志物成为可能。但如何有效验证和确认高分辨质谱揭示的成千上万的候选标志物是目前实现生物标志物临床转化的难点，让我们一起期待Stellar质谱在这一领域的精彩表现。

参考文献：

1. Heil L R, Remes P M, MacCoss M J. Comparison of unit resolution versus high-resolution accurate mass for parallel reaction monitoring[J]. Journal of Proteome Research, 2021, 20(9): 4435-4442.

2. Remes P M, Jacob C C, Heil L R, et al. Hybrid Quadrupole Mass Filter Radial Ejection Linear Ion Trap and Intelligent Data Acquisition Enable Highly Multiplex Targeted Proteomics[J]. bioRxiv, 2024: 2024.05. 31.596848.

3. Plubell D L, Remes P M, Wu C C, et al. Development of highly multiplex targeted proteomics assays in biofluids using the Stellar mass spectrometer[J]. bioRxiv, 2024: 2024.06. 04.597431.

4. Wahle M, Remes P M, Albrecht V, et al. A novel hybrid high speed mass spectrometer allows rapid translation from biomarker candidates to targeted clinical tests using 15N labeled proteins[J]. bioRxiv, 2024: 2024.06. 02.597029.

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