方案摘要
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美国戴安公司的LC-PACKING纳升级HPLC是当今世界最先 进的微量色谱之一.已经广泛应用于蛋白质组学的研究 领域.特别是其同MADLI TOF质谱的完全兼容性,使得LC- PACKING更是广大MADLI TOF质谱用户的最佳选择. LC Packings/Dionex /Nano LC 系统的组成: 1.UltiMate™微孔泵和检测单元 流速范围从 50 nl/mi n 到 200 µl/min,压力范围0-6000psi 2.FAMOS™ 微量自动进样器,样品体积:50nL-5 µl, 5 µl-1mL,注入样品量为 1 µl 输出样品量也是1µl (无样品丢失),取样对象可以是96、384多孔板,1.5ml 样品瓶(密封与开口均可,(双针技术)放置7块384孔 板,可连续取样2688次。内置双泵可以完成梯度2D色谱 分析. 3.Swithchos™ 微孔柱切换单元,允许全柱切换和快速 加载样品典型的装置。 4.Probot 微量样品收集器,是目前唯一一种可以直接将 分离样品点在MALDI TOF 质谱专用板上的样品收集仪 器.可以同ABI公司,布鲁克公司等大型TOF质谱直接连 接. 工作流程 用 FAMOS™向反向捕获柱注入样品, 使用Switchos™加 载泵以 30 µl/min的速度加载样品. 样品进到捕获柱后, Switchos 阀切换关闭, UltiMat e™ 单元的Nano梯度以 200 nl/min的速度将捕获柱中 的浓缩样品反冲到NanoLC的分析柱中,分析柱直径是7 5 µm ,填料是C18 PepMap™.,各种组分在这里分离然 后进入质谱检测。NanoLC的技术特点 1.提供了比 毛细管液相更高的灵敏度2.使用 Capillar y/Nano 柱,可在日常工作中达到最高的分离效率和极 好的峰容量 3.由于分析柱极小的直径,成为分析极少的样品量和稀 释样品的极好分析技术4.确保最少的样品丢失与质谱联 机有卓越的性能(特别是具有电喷雾离子源(ESI)的 在线质谱,可以最小的流速提供高浓度的样品) Capillary/Nano LC 与 MS联机: 1.可达到最高的灵敏度,使得毛细管/毫微级液相最佳 的分离效果与质谱最高的分辨检测结果有机地结合; 2、所有的进样、分离、检测和数据处理全部自动化: 全自动样品处理和导入、多维分离、MS/MS测序和采 集、数据库搜索;3、翻译后的修饰的鉴别;4、可大大 增加蛋白鉴别的通量。5、可与ESI、MALDI离子源质谱 联机 Peak parking 峰停驻技术 峰停驻技术用来增强 MS/MS 的灵敏度,用来分析不太复 杂的蛋白混合物(<50);峰停驻技术可配合使用原位消 化技术,使灵敏度增加(样品量减少,光谱信息增 加); 可改进数据质量和序列的覆盖面 原位消化技术 与2D胶相比可增加蛋白识别数量;可识别高含量蛋白污 染下存在的低丰量蛋白,同时极大地节省实验时间。 峰停驻技术可做下列描述: •进入质谱的峰淋洗速度被降低,使得有更多的时间识 别先进入的离子. •同时从 Nano LC分析柱来的淋洗液被停止. UltiMate™ 系统 提供Nano梯度淋洗(200 nl/min), 在 Nano LC (75 µm i.d.)柱中进行分离,被分离的组 分通过微量阀进入质谱,一旦进入质谱的峰达到一个确 定的峰高,MS将切换成MS/MS方式并得到MS/MS的光 谱 ,同时给出两个信号 :1、微量阀被通知关闭,喷 射泵与MS在线连接,喷射泵以 25 nl/min的速度工作, 给质谱留有更多的时间得到MS/MS光谱,. 2、UltiMate ™ 系统被通知保持梯度 (35%B remains 35%B) ,流 速进一步降低以保持柱压的稳定,一旦质谱中的峰从一 个确定的溢出或确定的高度开始下降,MS开始切换回质 谱的模式,微量阀和UltiMate™接到通知恢复到峰停驻 发生开始时的条件。 NanoLC 2维液相色谱技术 2维毛细管/NanoLC/MS可取代2D凝胶分析。2D凝胶被广 泛地应用在蛋白质组学的研究中,但它有下列的缺点: 1、重现形不好 2、覆盖的蛋白数量少 3、对低峰量蛋白的灵敏度不够 4、消耗时间和劳动力 5、pH范围有限 6、不能直接与质谱在线联机 以下是典型的UltiMate Nano LC系统2D分离的流程: 样品用FAMOS微量自动进样器注入到BioX-SCX离子交换 捕获柱上.通过自动进样器上的梯度泵缓慢梯度改变淋 洗盐溶液浓度(at 30 ul/min),从 BioX-SCX柱上将肽的 不同片段分别洗脱,并通过RP捕获柱分别收集,当捕集 到肽后,盐被冲洗出系统并确认盐不会进入MS,此时Nan oLC的主梯度泵(200 nl/min) 开始从捕获柱反冲肽 片段进入NanoLC毛细管分析柱,肽在这里被分离,最后 进入MS做定性。
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