基于二氧化钛富集策略的人类 磷酸化蛋白质组大规模鉴定

2018/01/29   下载量： 9 次

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应用领域 生物产业
检测样本 其他
检测项目
参考标准 磷酸化肽段 SCX 分级

在二氧化钛富集结合强阳离子交换分级的技术路线中， SCX 分级的梯度还值得进一步优化，对于这种组分较少 的预分级方法，阶梯洗脱会是一个更好的选择。这种大规 模的磷酸化肽段富集方法对样品的起始量要求比较高，如 果样品较少的话，建议采用二氧化钛富集结合强阳离子交 换的策略，一般 2 mg 起始蛋白就能得到较多的磷酸化位 点鉴定。ThermoFisher 也提供了商业化的 IMAC 试剂盒 （Cat # 88300），鉴于 IMAC 和 TiO2 对磷酸化肽段富集 有着较好的互补性，这两者联用会对磷酸化蛋白质组的深 度覆盖达到更好的效果。

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方案详情

蛋白质磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰，其在细胞周
期、细胞增殖分化、代谢和凋亡等各个生物学过程中都起
到了重要的调控作用。在真核生物中，约有 1/3 的蛋白质
处于其磷酸化状态，不同的蛋白质其磷酸化水平差异很大，
从低于 1% 到高达 90% 不等[1]。
磷酸化蛋白质组学面临着诸多技术挑战，如：磷酸化蛋白
质丰度较低且动态范围大，磷酸化肽段的离子化效率相
对偏低，磷酸修饰基团的具体位置难以确定，等等。在
目前的磷酸化蛋白质组学研究中，通常都需要在质谱分
析前对样品中的磷酸化肽段进行富集，以消除非修饰肽
段对于磷酸化肽段的鉴定抑制[2]。磷酸化肽段的富集方法
主要包括固定化金属亲和色谱（Immobilized Metal Affinity
Chromatography，IMAC）[3]，二氧化钛（Titanium dioxide,
TiO2）[4] 以及基于抗体的富集方法[5]。其中二氧化钛方法有
着富集效率高，简单易操作的优势，从而成为了目前最广
泛使用的富集方法。为了进一步增加磷酸化位点的鉴定深
度，通常需要对磷酸化肽段进行预分级，包括采用离子
交换色谱[6]，高 pH 反相色谱[7]，亲水相互作用色谱[8]，以
及 TiO2 多次富集[9] 等方法。在这部分工作中，我们采用
TiO2 富集结合多种肽段预分级的策略，通过 Orbitrap 采
集 HCD 产生的二级碎片离子，并最终使用MaxQuant 的
PTM score 系统进行磷酸化位点的确认，从而得到了高达
40,000 个位点的 Hela 细胞磷酸化蛋白质组深度覆盖。

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文献贡献者

赛默飞色谱与质谱
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