基于成像质谱显微镜对新鲜辣椒中辣椒素类物质的空间分布评价

1. 摘 要

辣椒中提取的天然成分辣椒素类物质（Capsaicinoids）因其具有降低胆固醇水平且预防心血管疾病等功效而受广大科研工作者的关注。目前对于辣椒素的研究主要集中在其分离提取工艺的优化，以及定量方法的开发上，对于其在新鲜组织中的空间分布的研究还尚属空白。本文基于成像质谱显微镜(Imaging Mass Microscope,iMScope TRIO) 技术，建立了辣椒素类物质在其新鲜组织上的原位空间分布的研究方法。借助iMScope TRIO前端搭载的高分辨光学显微镜，可以清晰的观察并定位到新鲜辣椒中的细微组织上，从而进行多点的质谱成像分析。后端配置离子阱和飞行时间串联质谱仪（IT-TOF），具有高质量分辨率的多级质谱分析功能，提供丰富的碎片信息，进一步验证辣椒素的结构。通过质谱成像技术，我们发现辣椒素类物质主要分布在包裹着辣椒籽的白色纤维上，其次才是辣椒籽本身，最后是辣椒的果肉部分。有效成分在新鲜植物中的空间定位分析，对于其不同种属的植物鉴定，品种改良，以及其食品安全方面具有广泛的应用前景。

2. 前 言

辣椒素类物质（Capsaicinoids）属于生物碱类，被认为是辣椒中的主要活性成分，研究发现辣椒素能够通过减少脂肪堆积，通过加快其分解代谢的方式而降低胆固醇水平，且在很大程度上预防心血管疾病。目前对于辣椒素类物质的研究主要集中在分离提取纯化工艺改进及其生物活性的相关研究，对于其在新鲜组织中的原位空间分布的研究尚属空白。辣椒素（Capsaicin）是辣椒中含量非常丰富的成分，其次是二氢辣椒素（Dihydrocapsaicin）以及诺香草胺（Nonivamide）^[1]。其化学结构式见图1。本文基于成像质谱显微镜( iMScope TRIO) 技术，通过高分辨显微镜对新鲜的辣椒切片进行细致的形态学上的观察，精准的定位到微小组织上。领先世界水平的5微米空间分辨率保证了微小组织上的高分辨成像。离子阱和飞行时间串联质谱仪（IT-TOF）对于确认目标物的结构提供了丰富的碎片信息。本研究建立了成像质谱显微镜技术对辣椒素类物质在组织中的空间分布的直接分析（不需要染色和标记）及其结构确证的方法，对于植物类样品中有效成分或者毒物毒素的原位分析来说具有重要意义。

3. 实 验

3.1 材料仪器

新鲜辣椒购自北京朝阳门华普超市。MALDI级别的a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), 购自西格玛公司。辣椒素（Capsaicin）和诺香草胺（Nonivamide）购自北京盛世康普化工技术研究院。HPLC级别的乙腈和甲醇购自默克公司。25 mm X 75 mm导电载玻片购自德尔塔科技公司。明胶购自西格玛公司。

3.2 切片的制作以及基质涂敷

新鲜辣椒清洗后晾干，用100 mg/ml明胶进行包埋。使用Leica CM1950在-20℃的环境下制作15μm厚新鲜辣椒纵截面切片。采用升华+喷涂的two-step基质涂敷方法，其中基质升华通过iMLayer自动升华仪完成。基质喷涂使用GSI Creos Airbrush完成。

3.3 基于iMScope TRIO 的质谱成像分析

分析条件

4. 结果与讨论

图 1. (A) 辣椒素(Capsaicin)和（B）诺香草胺(Nonivamide) 的化学结构及其单同位素质量

4.1 新鲜辣椒包埋并制作冷冻切片

图 2. 新鲜辣椒包埋并制作冷冻切片。(A).明胶包埋后的新鲜辣椒。(B). 15μm切片转移到ITO涂层玻璃上（标红的位置是选定的测定区域）

4.2 标准品在新鲜辣椒切片上的成像质谱分析

图 3. 标品诺香草胺（0.1 mg/ml）在新鲜辣椒切片上的多点质谱分析。(A). 滴定标品区域的光学图像 (B). 对应离子密度图（[M+H] +: m/z294.201） (C). 诺香草胺的一级平均质谱图 (D). 前体离子（[M+H]+: m/z 294.201）二级平均质谱图。

图 4. 标品辣椒素（0.1mg/ml）在新鲜辣椒切片上的多点质谱分析。(A). 滴定标品区域的光学图像 (B).对应离子密度图（[M+H] + m/z 306.201）(C). 辣椒素的一级平均质谱图 (D). 前体离子（[M+H] + m/z 306.201）二级平均质谱图。

4.3 新鲜辣椒切片上的成像质谱分析

图 5. 新鲜辣椒切片上的辣椒素类物质的多点质谱分析（放大倍数为1.25x）。(A1). 二氢辣椒素（[M+H] +:m/z 308.21）的一级离子密度图。(B1). 诺香草胺（[M+H] +:294.201）的一级离子密度图。(C1). 辣椒素（[M+H] +: m/z 306.201）的一级离子密度图 (D1). 新鲜辣椒切片光学图像和辣椒素质谱图像重叠 (A2)-(D1). 前体离子辣椒素（[M+H] +: m/z 306.201）的二级特征产物离子质谱成像图。Scale bar: 500 μm。

图 6. 辣椒籽及其附近区域辣椒素的多点质谱分析。(A) 辣椒切片整体光学图像（放大倍数为1.25x)(B) 辣椒籽附近的光学图像（放大倍数为5x）以及(C) 对应区域的辣椒素二维离子密度图 (D)-(G) 前体离子辣椒素（[M+H] +: m/z 306.201）的二级特征产物离子质谱成像图.Scale bar: 500 μm。

5. 结 论

通过iMScope TRIO前端搭载的高分辨光学显微镜拍摄的光学图像和相应的多点质谱图像的重叠，我们可以清晰地观察到辣椒素类物质含量最多的部分是包裹辣椒籽的白色纤维，其次是辣椒籽，最后是辣椒果肉。通过IT-TOF串联质谱提供丰富的碎片信息，进一步确认辣椒素类物质的结构。本研究成功建立了不需要染色和标记，直接评价辣椒素类物质在辣椒组织上原位空间分布的研究方法。为植物类样品中有效成分的原位分布研究开辟了新的途径。

6. 文 献

[1] Christopher A. Reilly et al. Determination of capsaicin, nonivamide, and dihydrocapsaicin in blood and tissue by liquid chromatography-tandem mass spectrometer Journal of Analytical Toxicology 2002.