生物工艺的优化过程需要不断探索培养条件与产率和质量之间的相关性,来获得更稳健的性能。PAT(Process Analytical Technology)作为一种通过及时测量原材料和加工过程的关键质量属性和性能属性来设计、分析和控制制造系统的方法,被认为在开发可靠的新工艺、提高产品质量方面具有巨大潜力。
沃特世始终关注行业对前沿分析技术的需求,将液相分析的理念从离线分析推进到过程液相分析PATROL UPLC。如果有效地将液相色谱技术作为PAT手段整合进入生物工艺开发工作流,对于提升效率和质量、降低成本具有非常重要的作用。但是由于液相色谱技术的特殊性,提升了对系统整合的要求,尤其是与生物反应器的联用,要考虑无菌取样、样品前处理、培养条件精准控制等需求。
通过与迪必尔生物工程(上海)有限公司合作,成功将PATROL UPLC与自动取样器和高通量生物反应器相结合,实现了生物反应过程的关键质量属性在线分析和自动反馈控制。通过这一系统,能够连续监测关键代谢物的浓度变化,有助于更深入的理解生物反应过程。
通过高通量平行生物反应器优化微生物培养环境,提供最适宜的生长条件,并利用上位机实现全过程的实时监控,如图2所示。配备微型自动取液器,实现样品的高效抽滤、定量和传送,确保样品处理的高效与精确。使用PATROL UPLC对样品进行液相分析,自动将关键参数数据上传至上位机,实现培养过程的精准控制和优化。
图2.PATROL UPLC与QuickFlow HT自动取样器和CloudReadyTM高通量生物反应器相结合实现过程控制。
在线取样和样品前处理
系统中使用0.1 μm陶瓷滤膜取样杆抽滤样品,可以有效替代12,000r/min 5min的离心和0.22 μm滤膜过滤的传统处理步骤。
取样和分析同步&工艺自动控制
使用Empower自有的定时取样序列,导出上传模板至微型自动取液器上位机,完成取样分析同步(图4)。Empower与高通量反应器上位机组网,创建同一局域网下的共享文件夹。迪必尔在其系统内配置相关参数,运行数据采集程序,向高通量反应器下位机写入数据,利用上位机的高级自动化控制功能实现反馈控制(图5)。
图4.自动取样分析同步。
图5.建立生物工艺过程中的自动反馈。
CloudReady™(1.5L)平行生物反应器联用PATROL UPLC分析乳酸含量优化发酵工艺
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是一种广泛应用于食品工业和医学领域的益生菌。它能够发酵多种糖类,特别是乳糖,生成乳酸。本案例采用CloudReady™(1.5L)平行生物反应器联用PATROL UPLC分析乳酸含量的方案优化发酵工艺,通过过程分析技术检测工艺优化过程中的乳酸产物,并且建立关键工艺参数pH值与产物产量的关系。
从pH和乳酸含量曲线图(图6)可以看出,pH控制在3.5时发酵前12 h乳酸含量最高,后续积累缓慢最终产量为最低值,初始pH控制在5.5时发酵前12 h乳酸含量低于R4,后续积累快速最终产量为最高值,初步推断,乳酸产生会导致培养基酸化,pH的降低影响了乳杆菌的生长和乳酸产率。乳酸含量大于15时,估计基础培养基耗尽,开启时序补料(图7)。通过工艺优化最终乳酸含量达33.77 g/L。
图6.pH、LAC、湿重图。
图7.根据乳酸含量开启补料时序。
PATROL UPLC在过程分析中具有广泛的应用前景,原理上基于液相色谱的分析可以同时检测不同浓度的多个组分,且在定量分析、灵敏度、线性/动态范围和分离度方面具有明显优势。希望该技术能够与更多的应用场景结合,提高工艺优化效率,为产品质量保驾护航。
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如您对本方案感兴趣,可发送邮件至Yuling_Song@waters.com。
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