治疗类生物药品组学研究>代谢组学检测 | LC系统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响：基于方法选择最佳色谱柱规格-沃特世科技（上海）有限公司(Waters)

方案摘要

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应用领域	制药/生物制药
检测样本	治疗类生物药品
检测项目	组学研究>代谢组学
参考标准	体积排阻、系统扩散、UPLC、UHPLC、HPLC、蛋白质、IgG、英夫利昔单抗 (Remicade?)

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的，是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一步增加。虽然使用粒径为亚2µm的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3µm 及以上，可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

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应用优势

1）教学式系统展示LC系统扩散对mAb的SEC分离的影响。

2）指导用户根据所使用的LC系统和分析方法要求(包括分离度、灵敏度、重现性和可转换性)选择最佳的SEC色谱柱配置。

3）展示ACQUITY™ UPLC™ H-Class Bio和ACQUITY Arc™ Bio系统的SEC分离性能。

简介

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的，是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一步增加。虽然使用粒径为亚2µm的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3µm 及以上，可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

结论

我们尝试系统性评估LC系统柱外扩散与SEC粒径、色谱柱内径和柱长在 mAb HMWS以及LMWS杂质分析中的相互影响。考虑到上述关系，我们开发了一套用于匹配沃特世UPLC和HPLC SEC色谱柱与首选用于SEC分离的三种沃特世LC系统的通用指南。

此外，这些数据表明，在某些SEC方法的稳定性测试中，柱外扩散的评估可能是一个重要变量。最后要注意的是，如果由于LC系统具有无法纠正的明显柱外扩散情况而阻碍了开发方法向其转换，则降低该方法的流速或增加色谱柱柱长可有效缓解其影响，且不会从根本上改变分离的选择性。读者还可参阅本应用纪要的姊妹篇《评估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响》 (沃特世应用纪要，部件号：720006337ZH)。除了SEC方法开发建议外，该出版物还包括SEC和系统扩散的其它数据和理论讨论。

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文献贡献者

沃特世科技（上海）有限公司(Waters)

钻石会员丨第21年

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