每当凛冬来临,各种病毒病原体愈发蠢蠢欲动,走了新冠病毒来了支原体,时不时甲流乙流也来发动助攻。当下使用智能手表检测心率、血氧饱和度等已经非常普及,那么有没有更好的方式能够及时发现来袭的各种讨厌的病毒呢?放心,来自全球各地的科学家正在火热的研究各种新鲜好玩的可穿戴传感器。
大家可能想不到,在这样一个揉合了多学科的好玩前沿领域中,名不见经传的多功能酶标仪(学名多功能微孔板检测仪),究竟能发挥什么样的作用呢?接下来,就让我们围观一下来自全球高端玩家的玩机指南吧!
无细胞冷冻干燥可穿戴技术(wFDCF)
来自哈佛大学Wyss生物启发工程研究所和麻省理工学院的研究人员开发了一种基于 CRISPR 技术的可穿戴的合成生物学传生物感器,在无需引入活工程细菌的情况下,只需简单的水溶液暴露,即可激活该生物传感器(wearable freeze-dried, cell-free, wFDCF),从而用以检测环境中的病原体和毒素,并发出荧光信号报告。更棒的是,研究团队还将这一技术集成到了标准口罩中,以检测患者呼吸中,以及空气中是否存在 SARS-CoV-2 病毒,该技术的检测限可以与目前的实验室方法(例如 qPCR)相媲美。
在这项研究种,Agilent BioTek 的 SynergyNEO HTS 多功能酶标仪主要用于适配 wFDCF 传感器的纺织物材料的高通量筛选,以及验证基于 CRISPR 的 wFDCF 传感器用于 RNA 直接检测的有效性这两方面。
SnynergyNEO 开展纺织品中 FDCF 合成生物学反应的高通量筛选
研究团队最初设计了一种基于比色法信号输出的 wFDCF 传感器,由三层皮肤安全材料制成的有机硅弹性体逐层组装而成,FDCF 反应传感器嵌入其中,组装好的传感器具有合适的弹性和柔韧性以支持可穿戴设计。液态样本在最上层的入口进入后通过毛细管作用快速进入反应室。合成生物学的电路传感器输出采用 LacZ β-半乳糖苷酶操纵子,其能够水解氯酚红-β-d-半乳糖苷(CPRG),当暴露于靶标后会发生黄到紫色的变化。通过这样的巧妙设计,研究团队测试了不同的传感器模型,用于检测小分子或病毒 RNA(图 1)。
图 1:比色法信号输出的 wFDCF 传感器设计示意图
随后,研究团队深入继续深入该传感器的检测灵敏度和适用范围,将其应用于日常穿戴的纺织物中,并开发基于荧光检测信号输出的检测体系,此项工作的第一步,便是筛选出更加适合的 FDCF 传感器纺织品载体。
筛选实验流程简介
先将 103 种织物样本预处理,包括去除颗粒、洗涤等,每种织物分为 BSA 封闭处理和未处理两组,干燥处理后用打孔器制成 2mm 的样本,每个样本设置三个重复,移入 384 孔板底部,对照组选择 Whatman No.4 号滤纸。
随后每孔内加入等量的包含 0.6mg/mL CPRG 的定制 LacZ 模板的 PURExpress 游离体外蛋白合成液,微孔板密封留孔后整板冻干。
冻干后的纺织物待测板子加入 ddH2O 水化至初始反应体积。
使用 SynergyNEO 微孔板检测仪在 37℃ 的条件下,对样本 384 孔板进行长达 12 小时的动态比色反应(OD420nm)检测,用于评价每种纺织物的 FDCF 传感器的合成生物学反应效果。
数据处理和筛选结果
动力学显色反应结束后在微孔板中可观察到明显的显色反应变化,SynergyNEO 和 Gen5 软件能够自动生成每个样本的动力学数据结果,用户后续的参数统计和分析(图 2)。通过 OD420 峰值吸收光强度、动力学平均反应速率、到达最大信号时间、滞后时间(LagTime)等动力学参数联合纺织物密度和自发荧光等参数,设计了筛选评分,最后研究团队选择了使用 85% 的聚酯纤维和 15% 的聚酰胺纤维的织物用于后续的荧光和发光信号输出传感器的载体(图 3)。
图 2:SynergyNEO 用于筛选 FDCF 适配的纺织物结果
图 3:wFDCF 比色纺织品筛选的归一化功能评分结果
SynergyNEO 验证 CRISPR-wFDCF 用于 RNA 直接检测的有效性
CRISPR 技术用于基因编辑领域已经是非常成熟和热门的技术,除了基因编辑,这项技术在分子检测领域也是大放异彩,早在 COVID-19 爆发不久,CRISPR 领域大神华人科学家张锋于 2020 年发表了使用 CRISPR 诊断工具检测新型冠状病毒 COVID-19 的 SHERLOCK 技术,详细介绍了标本提取和检测的方案。随后,马萨诸塞州剑桥市的夏洛克生物科学公司(Sherlock Biosciences)获得了美国食品和药物管理局 (FDA) 的紧急使用授权 (EUA),用于检测导致 COVID-19 的病毒的 SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2 试剂盒,这是 FDA 首次授权使用 CRISPR 技术。安捷伦的 BioTek SynergyNeo2 是当时市场上唯一被批准用于 SHERLOCK SARS-CoV-2 诊断测试的微孔板读板机。
由于 SHERLOCK 技术具有灵敏度高,响应速度快、单碱基对分辨率、冻干兼容性和面向任意 DNA/RNA 序列的可编程性等诸多优点,该研究团队将此技术融入到 wFDCF 的设计中,研究团队开发了一种可以检测呼出气溶胶中 SARS-CoV-2 的口罩,只需按下病毒外侧的按钮,启动传感器内三种不同的生物反应,第一种反应用于破坏新冠病毒的蛋白外壳,暴露其内部的 RNA;第二个反应是一个常温 PCR 扩增步骤,特异性扩增新冠病毒的刺突蛋白 (S 蛋白) 的基因片段;最后第三个反应使用基于 CRISPR-Cas13a 的 SHERLOCK 技术来检测病毒的 S 基因,被激活的 Cas13a 将荧光-DNA 探针分子切成两个更小的片段,在口罩内部的 LAF 窗口会显示出肉眼可见的条带(图 4)。
除此之外,研究团队还继续开发了光纤网络集成的 wFCDF 传感器,能够产生更客观可靠的荧光数据信号,可以通过智能手机的 APP 实时查看该信号。
图 4:口罩式用于检测 SARS-Cov-2 的集成化可穿戴设备设计
为了验证这种融合了 SHERLOCK 技术的 wFDCF 的有效性,使用 SynergyNEO 测试了 CRISPR-Cas13a 系统直接检测病毒 RNA 的效果。
检测流程简介
制备 A CRISPR-Cas13a-MRSA SHERLOCK RNA 纺织品冷冻干燥样本:反应体系包含可以被 Cas13a 切割的荧光探针底物 RNaseAlert,按前述操作转入微孔板中并进行冷冻干燥。
使用含有 20nM mecA RNA transcript trigger 的 ddH2O 水化处理微孔板中的冷冻干燥的纺织品生物传感器。
将微孔板置入 SynergyNEO 中,在 30℃ 条件检测荧光信号的动力学变化 (Ex. 470 nm/Em. 528nm, 30mins)。
微孔板检测结果和可穿戴设备的荧光显色反应进行平行对比。
检测结果分析
对可穿戴设备的荧光显色成像结果的信号强度做均一化处理后,其动力学曲线(图 5 绿色曲线)和微孔板荧光强度曲线(图 5 红色曲线)一致,此结果提示基于此 Cas13a 酶体系的 wFCDF 传感器的可穿戴设备平台具有良好的病毒 RNA 检测效果,除此。
图 5:wFDCF CRISPR-Cas13a 生物传感器直接检测 RNA 的效果验证
SynergyNeo2 多功能微孔板检测仪推荐
SynergyNeo2 是安捷伦微孔板检测家族中的顶级旗舰款,不仅融合了 Synergy 家族独特的 Hybrid 技术,具有独立的光路,确保在所有检测模式下均能获得出色的性能。此外其配备带宽连续可调的第四代四光栅系统,并搭载基于双平行 PMT 检测的超快速高灵敏滤光片光学模块,并且支持 TRF 激光器检测和 Alpha 激光器检测。
SynergyNeo2 主要优势
检测模式全面,包含连续波长吸收光、荧光强度检测、化学发光检测、FP、TRF、HTRF、TR-FRET、FRET、BRET、AlphaLISA 和 alphasgreen 检测模式。
独特Hybrid 光路:卓越的检测性能保证
超快速:最高可配置 4 个 PMT 用于超快测量
辅助检测功能丰富:包含先进的环境控制技术,温控至 70°C(这项功能在包括本文提到的 SHERLOCK 在内的恒温 PCR 技术中非常重要)和变速振荡,以支持活细胞分析。
自动化对接友好:BioStack Neo 可提供无人值守的自动化功能、高通量和条形码标记的滤光片模块,可以简化工作流程和降低出错率。
软件功能强大:Gen6 软件提供了全面的微孔板检测仪控制、强大的数据分析功能和 LIMS 集成功能。
应用范围广泛:涵盖基础研究到药物发现的多个领域应用。
参考文献
1. Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00950-3
2. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. https://www.nature.com/articles/s41596-019-0210-2
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