酶标仪高端玩家指南: 高通量LNP表观pKa测定

安捷伦科技(中国)有限公司

2024/09/13 17:07

脂质纳米颗粒（LNPs）是当下生物医药领域突破性的工具，特别是在 mRNA 疫苗和治疗的递送中显示出了其卓越的潜能。随着 COVID-19 mRNA 疫苗的成功应用，LNPs 的研究和开发获得了前所未有的关注。这其中，精确测定 LNPs 的表观 pKa 值对于优化其递送效率和安全性至关重要。

什么是 LNPs 的表观 pKa？

酸解离常数 (pKa) 的定义是体系中电离（质子化）基团和非电离基团数目相等时的 pH 值，因此，LNPs 的表观 pKa 就是 LNPs 中 50% 可电离脂质质子化的 pH 值。由于 pKa 决定了纳米粒子的电离和表面电荷，这极大地影响了它们的稳定性、效力和毒性，也影响了 LNPs 的细胞摄取、内体释放和生物分布，因此所以，精确测定 LNPs 的表观 pKa 对于设计和优化 mRNA 药物非常关键。

LNP 表观 pKa 测定的主要方法

目前 pKa 的测定方法包括酸碱滴定法和 TNS 荧光法，其中 TNS 荧光法具有灵敏高且操作便捷的优点，已被广泛用于测量 LNP 的 pKa，该方法可用 96 孔板体系配合高灵敏的荧光酶标仪实现高通量检测。

检测原理：TNS（2 - 对甲苯氨基 - 6 萘磺酸）在水溶液中是非荧光的，带负电荷，与阳离子脂类或聚合物结合并移动到疏水有机溶剂中显示出强烈的荧光如图 1 所示，随着 pH 值的降低，TNS 和可电离表面的相互作用增加，从而荧光稳定增加，当在特定的 pH 值下，所有的可电离基团带电荷，荧光值达到最大，通过达到最大荧光值的一半的 pH 估算 pKa。

图 1：使用 SynergyNeo2，设置激发光 321nm，扫描 TNS 的发射光光谱，扫描步进 1nm。获得 TNS 在 DMF 溶液中的荧光发射光谱，可见在 426nm 处有显著的发射峰。

TNS 法主要检测流程：

准备 buffer 溶液：pH 值在 3-10 pH（0.5 个单位变化）。

用不同梯度的 buffer 溶液稀释待测的 LNPs 和 TNS 溶液，调整终浓度为 30 和 6 µM，制备复孔并加入到96孔板中。

使用 SynergyNeo2 进行荧光读数 Ex/Em = 321nm/445nm），将均一化的荧光强度读数结果和 pH 值进行曲线拟合，计算 pKa。

实验结果展示

ALC-0135 和 SM-102 是用于 LNP 配方的可电离脂质。通过 TNS 测定 pKa 值。图 2 展示了 ALC-0135 和 SM-102 的 TNS 荧光滴定曲线。结果表明，ALC-0135 和 SM-102 脂质均可电离，其 pKa 值分别为 6.11 和 6.55。

图 2：可电离脂质的 TNS 荧光滴定曲线

此外，使用 SynergyNeo2 检测了装载 mRNA 的 LNPs 的表观 pKa，图 3 为不同 pH 值下 mRNA LNPs 的 TNS 荧光滴定曲线。结果表明，在低 pH 下，SM-102 LNPs 含有可电离基团，会带正电，从而抑制 TNS 自猝灭，产生强烈的荧光信号。在高 pH 下，SM-102 LNPs 将不带电。最后计算测得 mRNA LNP 表面 pKa 值约为 6.75，与文献一致。此外对照样本 DOTAP 是一种阳离子脂质，含有永久带电基团，因此在所有 pH 水平下都能够测得高荧光信号。