超速离心的差速沉淀及等密度梯度离心法
无论是国际顶级杂志的文献统计,还是国内用户的私下调研,超速离心一直都是作为外泌体或者说胞外囊泡分离纯化的金标准而存在。伴随着外泌体的发现、研究深入和产业转化,不断有各种“替代”方法、试剂盒出现,试图挑战超离在外泌体分离纯化方式中的领导地位,但至今仍未有成功。究其原因,超速离心也许是唯一一个可以同时用两个不同维度对外泌体进行分离纯化的实验方法。
每一种颗粒,例如外泌体,都会有其自身的一定特定属性,例如特定的大小区间、一定的密度范围、也许还有某些特别的表面标记物等等。以上每一种属性,只要能够与其他的颗粒存在足够的区分度,我们就可以相对应想办法进行识别和分离,这就构成了近百年来分子生物学的种种纯化手段。
以超速离心为例,其核心原理为沉降平衡方程:
v为每个颗粒在离心过程中的瞬时移动速度,d是颗粒直径, σ是颗粒密度,ρ介质液密度,?介质液年度,ω2r为转速及所处离心半径;
当两个或多个颗粒的直径d有显著差异时,其离心沉降速度也将会有较明显差别。直径大的颗粒很快就可以沉淀下来,而更小的颗粒需要更大的离心力或者更长的离心时间才可完成沉降。这就是我们最常用的差速沉淀的基本原理。例如10万xg离心1-3小时,就是最常见的把100nm左右的颗粒沉淀下来的实验条件。
但一种方法不可能是万能,当不同颗粒的大小比较接近时,基于大小的分离方法就会出现误差,把不同的颗粒都一起分离下来,虽然已经把过大或者过小的颗粒去除,但如果类似大小的杂质颗粒过多,实际上这也只能算是分离富集,而不能算作纯化。
为此,离心专家们又开发了另一种实验方案,人为地制造不同的介质液密度区间。基于上述沉降速度方程,每一个颗粒最终将会停留在跟它本身密度相同的位置。由于介质液按实验需要铺设成连续或不连续分布,最终不同样品也会根据密度的差异,形成不同的区间性分布。外泌体由于其脂膜结构(密度~1g/ml)包裹了一定量的核酸(密度1.4~1.7g/ml)及蛋白(密度1.2~1.4g/ml),导致其平均密度区间为1.13~1.19g/ml左右(实测值)。通过铺设不同的介质液分层,例如通过不同浓度的OptiPrep/蔗糖/TE Buffer,我们就可以人为的仅把符合此密度区间的颗粒给筛选出来。
不同的胞外囊泡,拥有不同的大小和密度分布区间,这类物理属性是我们在研究生物颗粒时最直观也是最准确的表观参数。超速离心法,正式通过大小和密度两个不同的维度,根据实验的需要,一步步地把我们所要重点研究的外泌体颗粒,从纷繁复杂的体液环境中、从不同的胞外囊泡中分离、富集和纯化下来。
下一期,我们将进一步对比分析其他基于试剂盒或其他实验原理的外泌体分离纯化方法,从中找出最适合我们不同实验所需的实验方案,以及超速离心为什么始终被认为是金标准的原因,敬请期待!
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