方案摘要
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本篇文章为大家介绍破骨细胞的传代、冻存与复苏实验流程。
一、实验动物:
成年SPF级雄性SD大鼠1只, 体重250g。
二、实验方法及步骤
1、外周血单个核细胞分离
(1)标本采集:取SPF 成年 SD 大鼠 1 只,3%戊巴比妥钠,按动物体重0.15 ml/100g,腹腔注射麻醉。无菌操作下腹主动脉采血6 ml,注入肝素抗凝管中。
(2)单个核细胞分离:采用密度梯度离心法, 向采集的血样标本内加入等量的PBS,取4支15ml离心管,分别加入大鼠淋巴细胞分离液各3ml,再缓缓向各离心管内加入上述含PBS血样各3ml,然后以2000r/min,水平离心20min,取出后在絮状层小心吸取单个核细胞,分别收集到2支离心管中,PBS清洗2次,备作重悬培养。
2、破骨细胞的诱导培养
将分离纯化的大鼠周围血单个核细胞,用含10%FBS、50ng/mlRANKL、20ng /mlM-CSF、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的 α-MEM培养液重悬,调整细胞密度为1×105个/ml。再将配制好的细胞悬液接种到6孔培养板与直径35 mm培养皿中。直径35mm培养皿用于活细胞工作站动态跟踪成像,6孔培养板置 于二氧化碳培养箱内,在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度下连续培养,用上述含RANKL、M-CSF的α-MEM 培养液换液,每3日1次。同时对整个培养过程作相差显微镜观察与活细胞成像,培养14 d作抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。
3、破骨细胞的传代
大鼠周围血单个核细胞经RANKL、M-CSF 诱导培养2周,形成大量贴壁的多核破骨细胞后,从二氧化碳培养箱中取出,将培养液吸净,加入37 ℃预温的D-Hank's液,冲洗2次,再滴加足0.25%胰蛋白酶液,使其覆盖整个底面,置于37 ℃培养箱中消化5min后取出,震荡1min左右,在倒置相差显微镜下观察,当大部分细胞收缩悬起后,加入α-MEM完全培养液终止消化,用吸管反复抽吸吹打,将细胞混匀后移入15ml离心管,2000r/min,离心5min,去上清,用含RANKL、M-CSF的α-MEM完全培养液重悬细胞, 调整浓度至1×105个/ml,接种细胞至6孔培养板与直径35mm 培养皿中。同时对消化与贴壁过程作活细胞成像观察,3d后作TRAP染色。
4、破骨细胞的冻存
按破骨细胞传代方法,将诱导培养的破骨细胞制成细胞悬液,2000r/min,离心5min,去上清,用DMSO、FBS、α-MEM 按1∶2∶7 比例配制的冻存液,重悬细胞,调整细胞浓度至5×106个/ml,加入冻存管,每支1.5ml,用冻存罐在温度为-80℃冰箱中放置24h,再移至-196 ℃液氮中冻存。
5、破骨细胞的复苏
从液氮中取出冻存的破骨细胞,迅速在 37 ℃水浴中震荡融解,将融解的细胞悬液加入15ml离心管中,再加6ml α-MEM完全培养液,混匀,2000r/min,离心5min,去上清,用含RANKL、M-CSF 的α -MEM完全培养液,按1×105个/ ml的细胞浓度重悬后,分别接种到6孔培养板与直径35mm培养皿中。同时对接种后的贴壁过程作活细胞成像观察,3d后作TRAP染色。
色,取出后去离子水冲洗,晾干,倒置显微镜下观察,DP-72 数字成像系统采集图像。
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