方案摘要
方案下载应用领域 | 医疗/卫生 |
检测样本 | 全血/血清/血浆 |
检测项目 | |
参考标准 | 企业 |
本方法快速省时、灵敏度高、样品用量少、操作简单,目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子,为心血管病,肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据,因而已成为医学和临床检验的常规技术。
实验原理
带电质点在电场作用下,带正电荷的移向负极,带负电荷的移向正极,这种现象称为电泳。蛋白质分子具有许多可解离的酸性基团和碱性基团,在一定的pH条件下,它会解离而带电,在某一pH下,蛋白质分子中所带的正电荷数恰好等于负电荷数,即分子静电荷等于零。此时蛋白质分子在电场中不移动,溶液的这一PH值称为该蛋白质的等电点。
当溶液的pH小于该蛋白质的等电点,则蛋白质分子会结合一部分H离子而带正电荷,在电场中就会向负极移,反之,如果溶液的pH大于该蛋白质的等电点,则蛋白质分子会解离出一部分H离子而带负电荷,在电场中就会向正极移动。
由于各蛋白质的等电点不同,在相同的pH溶液中所带的电荷性质不同,电荷的数目不同,因而在电场中泳动的方向和速度也不相同,从而使混合样品中的蛋白质各组分得到分离。
本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少而无“拖尾”现象。
本方法快速省时、灵敏度高、样品用量少、操作简单,目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子,为心血管病,肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据,因而已成为医学和临床检验的常规技术。
二、实验用品
(一)器材
(1)电泳仪和卧式电泳槽。
(2)分光光度计。
(3)醋酸纤维薄膜。
(4)培养皿和点样玻璃片。
(二)试剂
(1)巴比妥:巴比妥钠缓冲液
(2)染色液:称取0.5g氯基黑10B,加入蒸馏水40ml,甲醇50ml和冰醋酸10ml混匀,在具塞试剂瓶内贮存。
(3)透明液:冰醋酸25ml,加 95%乙醇75ml。
(4)漂洗液:乙醇45ml,冰醋酸5ml,蒸馏水50ml。
(6)定量洗脱液:0.4mol/L NaOH溶液。
材料
新鲜血清(无溶血现象)。
三、实验程序
(一)操作方法
1.仪器和薄膜的准备
(1)酸酸纤维薄膜的剪裁和准备:醋酸纤维膜分成有光泽和元光泽面两面,选择无光泽一面,距离边沿1.5cm处划一条直线,然后把薄膜剪成2×8cm,将裁好的薄膜无光泽面朝下,漂浮巴比妥缓冲液上,若漂浮的薄膜在15~30S内迅速润湿,整条薄膜色泽深浅一致,可以用于电泳。让膜自然下沉,待膜完全浸透约0.5h后取出,夹在清洁的滤纸中间轻轻吸去多余的缓冲液,同时分辨光泽面和无光泽面。
(2)制作滤纸桥:剪裁尺寸合适的滤纸条,取双层附着在电泳槽的支架上。使它的一端与支架前沿对齐,另一端浸入电极槽的缓冲液内,然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡,使滤纸紧贴在支架上,即为“滤纸桥”。按照同样的方法,在另一个电极槽的支架制作相同的滤纸桥。它们作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的桥梁。
(3)平衡:用平衡装置,使两个电极槽内缓冲液的液面彼此处于水平状态,一般需要平衡15~20min。
2.点样
在薄膜无光泽的一面点样。点样在距负极端1.5cm处。点样时,用玻璃片沾上血清,先在滤纸上练习点样,使血清均匀分布在点样区,形成具有一定宽度,粗细匀称的直线,试点熟练之后,开始点在醋酸纤维薄膜上。
电泳
用镊子将目点样端的薄膜平贴在电泳槽负极支架的滤纸桥上,另一端平贴于正极,薄膜要紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂。
染色
电泳完毕立即取出薄膜,直接浸入染色液中染色5min,取出后用漂洗液浸洗脱色,每隔10min左右换一次漂洗液,连续更换3次,可使背景颜色脱去,将膜夹于干净的滤纸中,用电吹风的冷风将膜吹干。操作中,要注意控制染色和漂洗的时间,防止背景过深或某些区带太浅。
结果判断
一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起,依次为清蛋白,a1球蛋白,,a2球蛋白,β球蛋白和r球蛋白。
透明
取一条漂洗清楚的电泳薄膜,待干燥后浸入透明液中约5min,取出平贴于玻璃板上,使完全干燥,即成透明膜,电泳图谱仍清晰可见,可以长期保存。
定量洗脱法
用洗脱法测定各蛋白质组分的相对百分含量。将电泳图谱的各区带剪下,分别浸于盛有0.4mol/L NaOH溶液的试管中,清蛋白管加入4ml氢氧化钠溶液,其余每管加2ml氢氧化钠溶液,揺匀,放入37℃恒温水浴中浸提30min,每隔10min充分摇动一次,以便将色泽完全洗脱下来。该溶液颜色较稳定,在室温下24h内颜色强度无显著变化,然后在620nm波长处比色,测定各管的光吸收值。分别计算血清各部分蛋白质所占百分率。
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