方案摘要
方案下载| 应用领域 | 食品/农产品 |
| 检测样本 | 水产品 |
| 检测项目 | 理化分析>其他 |
| 参考标准 | 企业 |
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。
一、实验原理
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。
为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：
（1）选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。
（2）用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀完全，然后方可时行离心分离。
（3）有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，最好立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。
（4）在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。
酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯（ pNP）在405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法，详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。
二、实验用品
(一)器材
(1) 髙速组织捣粹机和玻璃匀浆器。
(2) 离心机。
(3) 超级恒温水浴锅。
(4) 酸度计。
(5) 722分光光度计。
(6)天平、台秤。
(7)透析袋。
(8)磁力搅拌器。
(9)冰箱。
(10)秒表。
(11)50µL微量进样器。
（二）试剂
(1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.HCL PH7.5缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷1.214g，NaCl5.8g，溶于蒸馏水中，加入80ml 0.1mol/L HCL，用蒸馏水定容到1000ml。
(2)正丁醇（分析纯）。
(3) 硫酸铵(分析纯)。
(4) 0.5% NaCl：称取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸馏水中。
(5) 0.1 mol/L Na2C〇3-NaHC〇3 pH 10.1 缓冲液:分别取(A)液 70mL，（B)液30ml混匀，用酸度计准确调节pH 10.1。
(A) 0.1 mol/L Na2C〇3溶液：取 28.6 g Na2C〇3.10H20溶于1000 mL蒸馏水中 。
(B) 0.1 mol/L NaHC〇3 溶液：取 8.4 g NaHC〇3 溶于1000 mL蒸馏水中。
(6) 0.5 mol/L醋酸镁溶液：称取醋酸镁107.25 g溶于蒸馏水中，稀释成1000ml。
(7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液：称取醋酸钠8.2 g溶于蒸馏水中,稀释至1000 ml。
(8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液：取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000 mL。
(9) PH8.8 Tris.HCl缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g，用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml，即为0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL，加蒸馏水约800ml，再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL，混勻后用1 %醋酸调节pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。
(10) 丙酮(分析纯)。
(11) 95%乙醇(分析纯)。
(12) 20 mmol/L Mgcl2：称取 1.904 g Mgcl2溶于1000ml蒸馏水中。
(13) 0.1 mol/L NaOH：称取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸馏水中。
(14) 20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠（pNPP):称取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸馏水中。
(15) 底物溶液(5mmol/L pNPP)：按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2：0.50:.28。
(16)0.5µmol/mL对硝基苯酚（pNP=141.1)溶液:精确称取17.64mg对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250 mL。
文献贡献者
使用喷雾干燥技术在制备姜油树脂微胶囊的工艺研究
使用喷雾干燥技术制备三七皂苷微球的工艺参数研究
利用喷雾干燥技术制备麦饭石微胶囊的工艺方法研究
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