北京时间 1 月 25 日凌晨消息,新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺,缩写 DICY 或 DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量,但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点,本方法加大了净化材料的用量,以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的 Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管(500mg/15mL,货号: MS-SQA02)和 Venusil® HILIC 液相色谱柱,建立了奶粉中双氰胺的 MAS-QuEChERS 快速前处理方法和 LC-UV 以及 LC-MS/MS 检测方法。
1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
高效液相色谱仪,涡旋振荡器,超声波清洗机,氮吹仪。
双氰胺标准品(CAS: 461-58-5;FW=84.08),新一代Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管, Venusil® HILIC液相色谱柱,微孔滤膜,乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯,实验用水为超纯水。
表 1 双氰胺的信息
1.2 实验步骤
称取 1g 试样于 50mL 具塞离心管中,加 2mL 水,涡旋 30s,加 2ml 乙腈涡旋 30s。再往现有的提取液中加 2mL 乙腈,重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复 2 次,得到共计约 10mL 的提取液。以 4000r/min 离心 5min,将全部上清液加入新一代 Cleanert® MAS-QuChERS 管中(500mg/15mL), 将 MAS 管上下晃动 30s,然后涡旋 30s 后,8000r/min 离心 5min,取全部上清液(约 10ml)于玻璃试管中,50℃下氮气吹干,加入 1ml 乙腈复溶,过 0.22μm 微孔滤膜,待测。
注:1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂,防止加标瞬间发生蛋白沉淀;
2.乙腈提取分 4 次,为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快,影响提取效果。
1.3 实验条件
1.3.1 高效液相色谱法(HPLC 法):
色谱柱:Venusil® HILIC(5μm,100Å,4.6*250mm);
流动相: 10mmol/L 乙酸铵(pH=4.0):乙腈=15: 85;
波长:220nm;进样量:10µl;柱温:30℃;流速:0.8mL/min。
1.3.2 LC-MS/MS 法:
(1) 色谱条件:
色谱柱:Venusil® HILIC( 5μm,100Å,2.1*150mm);
流动相:
A:0.5mmol/L 乙酸铵(pH=4.0)
B:乙腈;
进样量:10µL;柱温:30℃;流速:0.3 mL/min。
表 2 流动相梯度程序
时间,min | A% | B% |
0 | 10 | 90 |
0.4 | 50 | 50 |
1.8 | 50 | 50 |
1.9 | 10 | 90 |
7 | 10 | 90 |
*备注:本文曾尝试过多种 C18 色谱柱,对双氰胺没有保留,需要使用离子对试剂,但是无法用于 LC-MS/MS;也曾尝试过 MERCK ZIC-HILIC 柱,但是得到双氰胺的峰面积偏差较大,分析原因是其具有阳离子交换基团,对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的 Venusil HILIC 柱,以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。
(2) 质谱条件:
质谱仪:API 4000+;离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测; CAD:8.00;CUR:20.00;GS1:60.00;GS2:50.00;IS:5500.00;TEM:600.00。
表 3 双氰胺质谱信息
药物名称 | 监测离子对 | DP | EP | CE | CXP |
双氰胺 | 85.1/68.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
85.1/43.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
注:带“ ”的监测离子对为定量离子对。
2 结果与讨论
2.1 高效液相色谱法:
2.1.1 双氰胺的液相色谱图
图 1 双氰胺 1µg/ml 标准溶液的液相色谱图
2.1.2 实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,作为标准贮备液;
分别称取 1g 奶粉试样,添加一定量标准溶液,配制成含双氰胺为 0.5µg/g,1µg/g,2µg/g,5.0µg/mL和 10µg/g 的添加样品,按照上述提取、净化方法操作,所得净化液按照上述色谱条件,依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标,峰面积为纵坐标,拟合线性方程,结果见表 4:
表 4 双氰胺线性方程和定量限(HPLC 法)
名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | 最低定量限(S/N=10) |
双氰胺 | 5.57min | Y=108.16X+27.827 | 0.9971 | 0.5µg/g |
2.1.3 准确度和精密度
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样,进行添加回收实验,结果见表 5
表 5 0.5µg/g 添加回收实验结果(HPLC 法)
平行 1 | 平行 2 | 平行 3 | 平均值 | RSD |
82.3% | 85.5% | 89.1% | 85.63% | 3.97% |
图 2 婴幼儿奶粉空白液相色谱图
图 3 婴幼儿奶粉 0.5µg/g 添加双氰胺的液相色谱图
2.2 LC-MS/MS 法
2.2.1 双氰胺的 LC-MS/MS 图
图 4 双氰胺 10ng/ml 标准溶液质谱图
2.2.2 实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中,加水溶液并稀释至刻度,作为标准贮备液;
分别称取 1g 奶粉试样,添加一定量标准溶液,配制成含双氰胺为 5ng/mL,10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL 和 200ng/mL 的添加样品,按照上述提取、净化方法操作,所得净化液按照上述液质条件, 依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标,峰面积为纵坐标,拟合线性方程,结果见表 6:
表 6 双氰胺线性方程和定量限(LC-MS/MS 法)
名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | 最低定量限(S/N=10) |
双氰胺 | 2.25min | Y=3859.1X+23694 | 0.9900 | 2ng/g |
2.2.3 准确度和精密度
选取市售某婴幼儿奶粉试样,进行添加回收实验,结果见表 7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液,双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化,故判断该方法无基质效应的影响。
表 7 10ng/g 添加回收实验结果
平行 1 | 平行 2 | 平行 3 | 平均值 | RSD |
82.5% | 83.5% | 89.3% | 85.2% | 4.31% |
图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图
图 6 婴幼儿奶粉 10ng/g 添加水平的质谱图
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