显微课程 | 激光显微切割的耗材

徕卡显微系统(上海)贸易有限公司

2024/09/27 17:37

TA的动态

不同应用的正确解决方案

激光显微解割（LMD）系统有许多不同类型的耗材。它们涵盖了从基础到高度专业化的广泛应用，使科学家能够根据自己的研究领域选择个性化的配置。

最常见的耗材是各种玻璃膜载玻片，结合标准盖子以收集解剖样本。还使用框架载玻片、带和不带 PEN 膜的培养皿、Ibidi 载玻片和多室培养载玻片。此外，徕卡 LMD 系统的灵活软件设置允许使用自制或定制的标本载体或激光微切割的收集装置。

一般来说，徕卡显微系统提供演示载玻片套件，其中包含不同类型的载玻片，以测试不同应用的不同可用膜，以找到最适合任何应用的膜载玻片。特别是对于荧光，测试不同的载玻片可以让你的生活更轻松。例如，PPS 相比于 PEN 具有更少的自发荧光，但 POL 或 PET 也可能适合你的荧光染料。

眼见为实，用于尝试、观察并相信！

LMD样本设备

玻璃膜载玻片

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用于激光显微切割的特殊膜安装在玻璃载玻片上，以实现最高质量的结果。覆盖有高UV吸收膜的玻璃载玻片，特别适合冷光照射（蒸发），称为玻璃膜载玻片。此类型的载玻片在图 1a 的左侧显示。

膜应用于玻璃载玻片的上表面，膜的边缘与玻璃粘合。因此，创建了一个矩形区域用于安装标本，其中膜与玻璃基底之间有空气。膜经过特殊涂层处理，以确保标本的最佳粘附。

一般来说，玻璃膜载玻片在膜辅助激光显微切割（LMD）中具有多种应用潜力，并配有不同应用的各种涂层。

小心处理薄膜对于避免膜损坏至关重要。应避免玻璃与膜之间的水分积聚，因为这可能导致切割物粘附在玻璃基底上。玻璃载玻片有两种不同的膜类型：

PPS（聚苯硫醚）

PEN（聚乙烯萘）

图 1a - 1c 分别展示了用于电机台、扫描台或 ITK LMT350 超台的标准样品架，放置了不同的载玻片。图 1 显示了一个玻璃载玻片（左）、一个框架载玻片（中）和一个 Ibidi®载玻片（右）。

图 1a：电机台的样品架

图 1b：扫描台的样品架

图 1c：LMT350 超阶段的标本架

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PEN 和 PPS 膜载玻片

（载玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用区域 19 x 41 mm）

标准载玻片具有 PEN 膜。这些膜可以用于大多数LMD应用，除了在植物研究中使用的极高激光能量。例如，PEN 膜有两种不同的厚度：2.0 µm 或 4 µm。4 µm 是一种特殊的发明，旨在与徕卡 LMD系统结合使用：该膜比 2 µm 标准膜更强，便于切片安装，并在安装过程中降低膜受损的风险，且膜本身更重，因此更容易通过重力收集。

PEN 膜片也有经过认证的 RNase 和 DNase 自由版本，以保证在 DNA 和 RNA 研究中无污染的工作。与 PEN 膜片一样，PPS 涂层膜片也可以在几乎所有激光辅助显微切割技术中使用。PPS 膜片的自发荧光较少，表面结构比 PEN 膜片更光滑，但在化学处理（例如，二甲苯）方面的耐受性不如 PEN 膜片。当使用玻璃片时，重要的是将其放入标本架中，组织面朝下。否则，所需区域将被切割，但会掉落在膜和捕获装置之间的玻璃底座上，而不是被捕获在收集容器中。

大型 PEN 和 PPS 载玻片

（载玻片尺寸：52 x 76 mm，LMD 可用区域 39 x 45 mm）

这些是用于特别大标本的 PEN 或 PPS 膜玻璃载玻片，例如在神经科学中使用的组织切片。可提供特殊的标本夹用于显微解剖。大玻璃载玻片可见于图 2a 和 2b。

图 2a 和 2b：该标本夹可用于大型 PEN 或 PPS 载玻片以及培养皿（参见图 10a）。

框架载玻片

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（载玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用区域 16 x 45 mm）

框架载玻片由金属框架组成，可以覆盖各种膜（图 4b）。此类型载玻片可用的膜如下：

PEN（聚对苯二甲酸萘酯）

PPS（聚苯硫醚）

PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）

POL（聚酯）

FLUO（氟碳）

结合特殊的 150 倍干式物镜（图 3），它在不需要浸油的情况下提供亚细胞分辨率，框架载玻片非常适合单细胞和染色体应用。当使用框架载玻片时，解剖样本直接粘附在箔片上，因此特别适合于极小样本的解剖，例如染色体解剖。框架支撑具有凸起的表面结构，恰好适合框架载玻片前部的凹 cavity，便于将组织切片固定到膜上。这创造了一个平坦的表面并支撑膜。框架支撑在某种程度上形成了膜的骨架，为在样本准备过程中将样本施加到膜上提供了足够的阻力和张力（图 4）

图 3：150 倍干式物镜，专为与 POL 膜载玻片结合而设计，用于解剖每一个微小样本。

然而，框架滑片可以在没有框架支撑的情况下用于安装组织切片。

像适当涂层的玻璃膜滑片一样，带有 PPS 膜的框架滑片几乎可以用于任何应用。

而带有 POL 膜的框架滑片主要用于染色体解剖（Post 等，MolEcoNotes，2006），结合 150 倍干物镜，带有 PET 膜的框架滑片则非常适合后续的质谱分析技术（Drummond 等，Acta Neuropathol 2017）。与其他可用膜相比，PET 几乎不含增塑剂，这些增塑剂可以通过 HPLC 与蛋白质分离。这些增塑剂可能会阻塞部分质谱图谱，使得某些频带无法在被阻塞的频谱区域中观察到。类似的现象也可以在用于收集的 PCR 管中观察到。

特殊的 FLUO 膜特别适合荧光、PH 和真正的DIC。

图 4：带有膜和框架支撑的金属框架作为“骨干”。

框架载玻片也可以用作活细胞培养的样本载体。因此，载玻片的矩形腔体被用作培养皿。建议在这种培养中，将载玻片放入更大的培养皿中，并在将细胞接种到腔体膜上后完全覆盖培养基。如果使用 PEN 膜，培养细胞的形态不会改变，而其他类型的膜可能会由于不同膜的表面特性导致培养细胞的形态不同。

可以为难以附着在膜上的样本创建两个框架滑片的夹层：简单地将样本夹在两个框架的膜之间，激光足够强大，可以切割这样的夹层堆叠。液滴或涂抹制备也可以轻松应用于使用框架滑片的激光显微切割。

对于植物应用以及其他硬组织如骨头、牙齿等，推荐使用框架滑片，因为它们比玻璃滑片更能兼容高激光功率。高激光功率可能会边缘玻璃，使得附着在其上的材料更难切割。

对于植物样本如叶子，根本不需要膜载玻片作为载体，因为这种材料可以直接应用于激光微切割（Hölscher，Rec Adv Polyphenol Res（2019））。

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激光微切割的采集设备

盖子/微量离心管

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在LMD解剖后，样本在重力作用下掉入收集容器，例如标准的薄壁微离心管及其盖子。不同滑片与盖子的组合是激光显微解剖中最常见的应用之一。通常使用标准的 0.2 毫升和 0.5 毫升管，盖子可以是空的（干燥的）或装有合适的缓冲液或类似的适宜介质。例如，盖子中含有 RNase 抑制剂的溶液可以防止核酸在激光显微解剖过程后立即分解。同样，蛋白质也可以通过缓冲液保持在稳定状态。空的、干燥的盖子提供了一种良好的识别解剖样本的方法，并且可以通过拍摄前后照片进行轻松比较。基本上，微解剖样本可以转移到任何标准盖子上。图 5a 和 5b 显示了盖子和微离心管的匹配收集器。尽管可以使用特殊的 OptiCaps（#11505169），但对于徕卡激光显微解剖来说，这些并不是必需的。OptiCaps 具有集成的光学元件，以确保最佳的照明均匀性，并且可能是“粘性”的。然而，Leica LMD 系统不需要使用昂贵的非标准管盖，因为收集过程是重力驱动的，不需要克服重力。

此外，还有 1.5 毫升的管子，配有硅胶填充的盖子。在 LMT350 超阶段的多收集器中，借助杠杆，这个填充的盖子可以与膜上的组织接触。这个设置有助于收集具有挑战性的粘性样本。

还有可能收集到特殊的样本设备中，例如用于组织均质化、蛋白质提取和通过压力循环技术消化的 PCT 微管（PCT, PressureBioSciences Inc.）。直接收集到这些设备中可以节省时间，因为不需要重新移液。

图 5：用于收集盖子和微量离心管的特殊收集装置可以用于正常尺寸的 0.2 毫升（a）和 0.5 毫升（b）。收集器直接位于样本下方，解剖物因重力作用直接落入管盖中。

适用于 8 孔条、8 孔和 12 孔条盖以及多孔载玻片（如 18 孔 Ibidi 载玻片或 LOC（实验室芯片）载玻片的通用支架。

适用于不同收集设备的通用支架在同一载体中独特于徕卡，并提供多种不同收集设备的选项，适用于不同的应用。此外，通用支架可调节高度，以将所选收集器调整至靠近标本载体，以实现最小的落距。

8 孔条可用于大容量应用（例如，将活细胞收集到培养基中），8 孔条盖非常适合高通量应用。此外，通用支架适合携带室内载玻片、多孔载玻片以及 LOC（实验室芯片）设备，如 Ibidi®载玻片。所有设备均可用作激光显微切割的收集设备。

8条LCC

这些收集器的开发旨在提高对解剖活细胞后续检查的样本通量，并可以组合在一起形成 96 孔板。图 6a 和 6b 各显示了一个适合的持有器，带有 8 孔条 LCC，可以组合形成孔板。孔板是进行细胞培养高通量筛选的基础。

使用这样的筛选技术，可以在极短的时间内分析大量单细胞培养，并在必要时进行再培养。

图 6a 和 6b：8 孔条作为解剖收集器，使细胞培养的高通量筛选成为可能。

8 孔和 12 孔条盖（用于分子生物学/PCR）

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0.2 毫升 8 孔条的盖子可以用作激光显微切割的收集器。在激光显微切割后，8 孔条的盖子可以放在 0.2 毫升 8 孔条或 96 孔 PCR 板上，直接插入 PCR 机器（可根据要求提供）。使用 8 孔条在后续 PCR、定量 PCR 或其他加热或冷却过程中，特别适合处理大量样本。

图 7a 和 7b：8 孔条盖

可调高度的 48 孔收集器（图 8）允许同时使用六个 8 孔条，这样在一次实验中以最小的努力就可以轻松填充 96 孔板。

通用支架也适用于其他 LOC 设备，例如 18 孔 Ibidi®载玻片和用于活细胞培养应用的腔室载玻片（图 9）。任何自制的收集装置，只要具有载玻片的 x-y 尺寸，也可以与此支架结合使用。

图 8：48 孔收集器

图 9：带有腔室滑片的通用支架作为收集装置。

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用于 LCC 模式的耗材

有多种与激光解剖、操作和选择技术兼容的标本载体，适用于 LCC（活细胞培养）。徕卡提供特定于LMD的耗材用于活细胞处理：

培养皿（带或不带 PEN 膜）

Ibidi®滑片（带或不带 PEN膜）

这些带有 PEN 膜的耗材可以作为解剖的标本载体，或者，即使没有 PEN 膜，也可以作为活细胞激光操作的标本载体，或者作为再培养、克隆或下游分析的收集容器。

框滑片的矩形腔体也可以用于细胞培养（见上文 → 框滑片）。

此外，带有 PEN 膜的培养皿以及 Ibidi® 滑片可以与常用的收集器（0.5 毫升管、0.2 毫升管、8 孔条、8 条管盖、Ibidi 滑片、常规培养皿、多室培养滑片和 96 孔板）结合使用。

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图 10a：一个培养皿和一个带有 PEN 膜的 18 孔 ibidi 载玻片，用于活细胞培养。

培养皿

培养皿通常适合活细胞培养（LCC），并且有带或不带 PEN 膜的版本。图 10b 显示了已经在图 2a 和 2b 中说明的大型 PEN/PPS 载玻片和培养皿的样品架；一个带 PEN 膜的培养皿已被插入，代替了大型载玻片。图 10c 显示了将培养皿用作收集器的情况。

不带 PEN 膜的培养皿

（Ø 50 毫米）

不带 PEN 膜的传统培养皿用于收集和再培养解剖物。不带 PEN 膜的培养皿不能在激光显微解剖的样品架中使用，但可以用于活细胞操作实验。然而，选定区域可以使用LMD激光进行操作，并通过延时电影功能观察长时间。

带 PEN 膜的培养皿

(Ø 50 mm，适用于LMD的可用区域 Ø 30 mm)

在带有 PEN 膜的培养皿中培养的细胞可以在 LCC 模式下进行解剖，并转移到其他培养皿（带或不带 PEN 膜）或其他合适的收集容器中。膜可以涂覆聚-L-赖氨酸或胶原蛋白，以提高粘附性和细胞生长。

Ibidi®载玻片

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（载玻片尺寸：26 x 76 mm，每个孔适用 30 µl 液体）

这些载玻片配备了专门设计用于激光显微解剖活细胞的孔。每个载玻片有 18 个凹槽，底部为 PEN 膜。

Ibidi® 幻灯片可以与适用于 LCC 模式的所有收集器组合使用。

图 11a：用于 ibidi 幻灯片的 LMT350 超级台的幻灯片支架。

另一种无污染的选择变体是所谓的幻灯片堆叠（图 11b、11c），由两个 Ibidi 幻灯片以三明治技术叠放而成。从这样的堆叠中解剖的细胞会因重力直接落入下方固定在特殊堆叠支架中的 Ibidi 幻灯片中（图 11b、11c）。后续的再培养以及提取细胞的下游分析都是可能的。

匹配的盖子提供了进一步的污染保护选项。

Ibidi® 幻灯片也可以与通用支架结合使用，作为 LOC 设备的收集装置（图 11c）。

97-96孔板

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对于需要更高通量的实验，还有一种解决方案。96 孔标准 PCR 板（半裙边、无裙边或全裙边）使用户能够并行收集多达 96 个不同实验的材料。这些板可以直接放入标准 PCR 机器中。此外，还有用于活细胞的 96 孔板支架，例如用于克隆目的。

还有一个收集器选项，可以直接解剖到由公司Covaris®制造的特殊 96 孔板中，以进行超声处理。

图 12a：与 LMT350 超级平台一起使用的无裙边 96 孔板作为收集器。图 12b、12c 和 12d：无裙边、半裙边和活细胞 96 孔板的收集支架。

表 1：激光显微解剖用膜滑片和培养皿 – 根据膜类型、膜支撑和使用的物镜比较切割性能。激光显微解剖性能：– 不适合；+ 满意；++ 良好；+++ 非常好。ª这些物镜在与最佳图像质量结合时，具有改进的光学性能以传输 UV 光。D 代表校正环的位置。

表 2：LMD 耗材与 LMD 阶段的兼容性。

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关于徕卡显微系统

徕卡显微系统的历史最早可追溯到19世纪，作为德国著名的光学制造企业，徕卡显微成像系统拥有170余年显微镜生产历史，逐步发展成为显微成像系统行业的领先的厂商之一。徕卡显微成像系统一贯注重产品研发和最新技术应用，并保证产品质量一直走在显微镜制造行业的前列。

徕卡显微系统始终与科学界保持密切联系，不断推出为客户度身定制的显微解决方案。徕卡显微成像系统主要分为三个业务部门：生命科学与研究显微、工业显微与手术显微部门。徕卡在欧洲、亚洲与北美有7大产品研发中心与6大生产基地，在二十多个国家设有销售及服务分支机构，总部位于德国维兹拉(Wetzlar)。

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