全光谱高分辨激光共聚焦成像系统：实时荧光寿命成像的不二之选

徕卡显微系统(上海)贸易有限公司

2024/10/21 18:46

本文转载自浙大实验设备处公众号

编者说

大型科研仪器是科研实现原创性突破的利器，开放共享开辟了科技创新的新赛道。为促使我校大型仪器共享与服务水平上一个新的台阶，让“器”的投入最终在“智”上显出更广更大的效应和价值，实验室与设备管理处微信公众号将陆续推出“大仪说”系列报道，旨在帮助校内外用户深入了解学校大型科研仪器设备，促进共享与合作。

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传统激光共聚焦显微镜以单谱线激光器作为光源，利用不同荧光探针标记生物样本内不同组分，分析荧光强度参数实现较高的成像对比度和特异性，但检测结果易受荧光团浓度、激发光强度、光漂白等因素影响。荧光寿命成像技术（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）不受激发光强度、荧光团浓度、光漂白等因素影响。荧光寿命与荧光团所处的微环境密切相关，能反映微环境中pH、折射率、离子浓度等变化，是荧光团的固有属性。通过测量荧光寿命可精准定量不同样本或实时分析处于不同状态的生物样品，获得与荧光光谱技术、荧光强度检测技术互补的结构与功能信息。荧光寿命测量系统基于激光扫描共聚焦显微系统（LSCM）的搭建，荧光寿命成像变得高效且简单。

图1. 小鼠胚胎的荧光寿命图像

图示短寿命蓝色，中等寿命黄色，长寿命为橙色和红色。722个视野拼接，拟合出4个独立的特征寿命，采集时间约1小时，传统方法约1天。

与传统激光共聚焦显微镜相比，全光谱激光共聚焦激发端可在440-790nm波段内任意调节，检测端可在410-850 nm内接收荧光信号，激发光和荧光得到精准最高效的利用，实现了对目前市面上多数近红外染料标记成像的需求。因其激发与发射光谱的自由设置，染料可自由选择，轻松实现特殊染料成像、多色成像、光谱近似的染料成像区分、目标标记和自发荧光成像区分等多种普通共聚焦无法实现的高端实验。

图2.多色荧光成像（7色）

图示由医学院公共技术平台组织形态学分平台提供的多标记肿瘤组织，七色成像，精准获得不同标记的位置和形态信息。

浙江大学医学院公共技术平台引进的全新全光谱高分辨激光共聚焦成像系统（Stellaris 8 Falcon），一改传统共聚焦固定谱线的激光激发成像模式，基于灵活设置的激发端和高灵敏的检测端，不仅实现了高分辨率的快速共聚焦多色成像、近远红染料成像等，更是理想的寿命成像和分析设备，在生物医学研究中具有较大的应用潜力。

图3. 全光谱高分辨激光共聚焦成像系统（Stellaris 8 Falcon）

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该设备的工作原理是什么？

该设备基于倒置激光共聚焦显微镜，集成了全光谱连续可调脉冲激光器激发系统，搭载精准光子计数模式高灵敏混合探测器（HyD），不仅可实现强度成像，也让荧光寿命成像变得高效且简单。

荧光寿命是指分子停留在激发态的平均时间ns。通过观察足够大量的激发-发射事件集合来测量荧光染料的典型寿命。测量图像中所有像素平均光子到达时间，即荧光寿命成像(FLIM）。荧光寿命范围一般在0.2-20ns之间，反映了荧光分子内在属性和所处微环境。

图4. 荧光寿命成像原理

在功能上有什么独特性和先进性？

1）荧光强度测量。配备自由连续可调脉冲白激光器，拥有351根激发谱线，可同时分离8根激光谱线；加上超高灵敏度荧光检测范围达850 nm的检测器。自由选择染料并同时8色成像，轻松实现一些特殊染料或近红外染料的快速成像。

2）荧光寿命测量。实现视频速率的快速荧光寿命成像，可用于监测代谢状态和微环境变化、分子间快速相互作用(FLIM-FRET)、膜张力研究（Flipper-TR）、不同寿命组分高效拆分等。

荧光寿命检测模块和共聚焦的整合，既能做最基础的单光子共聚焦成像，又能实现高分辨的高精度特殊多色成像。可在亚细胞水平上检测Ca²⁺、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。同时具备FLIM荧光寿命成像功能支持多种应用。

该设备为科学研究带来哪些新应用？

该设备是目前功能极为全面的全光谱激光共聚焦成像系统。具备FLIM荧光寿命成像模块、Lightning高分辨成像模块、共聚焦常规模块（3D、时间、多点、光谱扫描、大视野拼图）和活细胞孵育系统，除了完成细胞或组织内荧光信号的检测外，还可开展FLIM荧光寿命成像，FLIM-FRET、组分分析分离、局部离子浓度、微环境(如pH值)、区分光谱近似的染料、区分染料和自发荧光等多种普通共聚焦无法实现的高端实验。

在传统荧光强度和荧光光谱两个维度的基础上，又增加了荧光寿命这一新的成像维度，大大拓展了该系统在细胞生物学、生物化学、生理学、神经生物学等众多学科中的应用。

目前有哪些应用案例?

在功能成像领域中，监测小分子、离子或电势的动态变化，通常是用荧光探针来完成，其中多数显示出强度和寿命的变化。也可以用荧光蛋白装饰蛋白质，并在活细胞中表达这些构建体。最为现代化的工具是蛋白质或肽，它们与所需的分析物（如Ca²⁺）结合，并装饰有一对进行FRET的荧光蛋白。结合分析物后，肽发生构象变化，FRET将出现或消失。这些探针被称为FRET-生物传感器。生物传感器的一种是利用cAMP结合蛋白Epac。

图5. FRET跟踪活细胞中的分子相互作用

图示用游离态的cAMP刺激培养细胞，并用Epac FRET-生物传感器进行监测。在红色圆圈区域分析信号（平均到达时间tₐ）。随时间变化的图示见底部。由K.Jalink，B.van den Broek，NKI Amsterdam(NL)提供。

FALCON的计数速度足够快，可在活细胞中使用化学传感器和FRET生物传感器进行荧光寿命成像。无染色应用是分析活体材料中的内源性荧光。例如：癌细胞抑制细胞呼吸，倾向于无氧糖酵解（瓦博格效应），这会导致积累更高浓度的荧光NADH。即使没有活检，多光子显微镜也能在皮肤组织中进行深度成像。同样，寿命对比度要可靠得多，因为深层的显微镜会受到吸收和阴影效应的影响，从而使强度信号失真。

传统意义上，不同的荧光染料以其不同的颜色来区分。如果激发和发射相同，仍可通过寿命进行区分。发射强度和寿命可以作为颜色的函数独立记录。因此，可见荧光染料的数量是发射光谱和拟合寿命的乘积。

图6. lt-染料分离的原理证据（6个信号）

图示用480 nm激发云杉叶的新鲜切片，在两个通道（顶部和底部行）中进行记录，每个通道可分开显示三个寿命（从左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。

这台设备开放共享情况如何？可以通过什么途径联系使用它？

全光谱高分辨激光共聚焦成像系统自2023年6月引进正式投入使用以来，已服务浙江大学医学院、药学院、生命科学学院、农业与生物技术学院、化学工程与生物工程学院、附属医院等校内外多家单位，累计机时近两千小时，培训师生近百人。未来，我们希望继续提高设备利用率，加强开放共享，更好的服务广大科研用户，期待与更多单位开展合作研究。

如果需要使用这台仪器，可登入浙江大学医学院公共技术平台网站或联系杨老师进行预约。

医学院公共平台网址：

https://www.cfzsm.zju.edu.cn

联系方式：

杨老师 0919304@zju.edu.cn

0571-88206765