COLD-PCR和高分辨率溶解结合使用，高效的筛查和鉴定癌症基因低水平的未知突变

数字PCR，LunaProbesTM和MAAB相结合可以检测到低于0.01%的等位基因的突变

简介：低水平突变的检测促使了许多新方法的发展。我们结合现有的三个技术：数字PCR，非标记探针法和MAAB（突变等位基因的偏向性扩增）（见图1）。数字PCR（Vogelstein and Kinzler，1999）需要许多重复的样本使模板稀释至约1拷贝/反应。将原始的数字PCR进行一些改进后可以进行高分辨溶解曲线分析（HRM），要求模板稀释为5个拷贝/反应 (McKinney, 2007)。这表明，如果存在突变的等位基因，一个反应中至少包括20%的等位基因并且可以检测到异源双链的存在。通常数字PCR检测的灵敏度约为2%。并且灵敏度是可以增加的，这主要取决于重复检测的数量。非标记探针法在PCR反应中加入3’端封闭的非标记寡核苷酸（Zhou，2005）。在使用HRM仪器时除了进行扫描之外，非标记探针增加了基因分型的功能（见图2）。非标记探针的灵敏度大约在5%（Wall，2007）。MAAB利用非标记探针增加了稳定性，探针与野生型等位基因完全匹配，和突变的等位基因不完全匹配，使突变的等位基因得到优势扩增。MAAB的灵敏度可以低于1%（McKinney，2009）。本实验中，我们结合这三种方法来增加HRM的灵敏性和有效性。 如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn